脂肪酸转位酶（CD36）是一类分子量为88 kD的单链跨膜糖蛋白，广泛分布于单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、心脏肌细胞等组织器官细胞表面，作为受体能与多种配体结合，主要介导脂肪酸的跨膜运输[1-3]。CD36在生物体内主导长链脂肪酸的摄入，促进细胞对其利用，生成脂肪、蛋白质、葡萄糖等化合物，进而合成DNA、RNA等影响生物体生命活动的大分子物质，若代谢紊乱，会诱发2型糖尿病、冠心病、肥胖等疾病[4-6]。CD36基因突变会影响胰岛素耐受性、脂联素、脂质含量和有氧代谢表型[7-8]。研究发现，CD36基因多态性与腰围和体重指数具有一定的相关性[9-10]。因此，推测CD36基因与牛的生长性能及肉质品质具有一定的关联。平凉红牛是将秦川牛引入甘肃陇东地区后，经过长期选择和选育，形成具有南德温、安格斯、夏洛莱等国外品种血统并适应当地自然环境和生产条件的全身被毛红色的肉牛群体[11]。平凉红牛产肉性能优良，肉品风味独特，肉质鲜嫩，肌内脂肪含量丰富，富含共轭亚油酸（CLA），具有生产高档雪花牛肉的潜力，是陇东地区畜牧业发展的重要种质资源[12]。但CD36基因与平凉红牛生长性能及肉质品质关联的研究还尚未报道。因此，本试验拟利用PCR-SSCP技术、DNA测序技术、实时荧光定量PCR（qPCR）技术对平凉红牛CD36基因exon 8进行遗传变异分析，判定SNPs位点基因型分型和测定不同组织器官中CD36基因mRNA表达量，分析其与平凉红牛生长性能及肉质性状的相关性，为平凉红牛的遗传选育提供参考。1材料与方法1.1样品采集平凉红牛选自饲养条件相近的平凉地区养殖场，共340头。选择3头牛颈静脉采血6 mL，置于含EDTA-Na的采血管中-20 ℃保存。待18月龄时，选择相应的3头红牛屠宰，测定宰前活重、胴体重、眼肌面积、背膘厚度、肌内脂肪含量等肉品质指标，采集腿肌、背最长肌、心脏、肝脏4个部位的肉品，-80 ℃冰箱保存。1.2基因组DNA提取试剂盒法提取基因组DNA，使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度，使用紫外分光光度计测定DNA水平和OD260/280值。1.3引物设计及PCR扩增参考NCBI数据库中基因序列GenBank ID: NC_037331.1、MK714346.1、NM_001278621.1，采用Oligo 6软件设计引物，并由北京天一辉远公司合成，引物信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T001表1引物信息基因引物（5'→3'）退火温度/℃扩增长度/bpCD36-8F：GAAGGTGCTCCTGAAATG60171R：TGATGGAAGATTTGTGGG以DNA为模板进行PCR扩增，反应总体积为20 μL，各成分组成为：2×Pfu PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL，上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，DNA 1 μL。PCR反应程序见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T002表2PCR反应程序项目温度/℃时间/s循环/次预变性94.02400变性94.04030退火60.03530延伸72.03530最后延伸72.036001.4SSCP分型及测序取3 µL PCR扩增产物与8 µL loading buffer混匀，98 ℃变性10 min，取出，置于-20 ℃冰箱冷却15 min，加样，在4 ℃、150 V电压下电泳13~15 h。电泳结束取出凝胶，对凝胶进行银染法染色，根据染色后条带的分布判定基因型，将不同基因型PCR产物送到北京天一辉远公司进行纯化与测序。1.5总RNA提取及反转录试剂盒法提取不同部位样品总RNA，使用核酸蛋白测定仪检测RNA含量。反转录试剂盒法获得cDNA，cDNA于-20 ℃冰箱保存，反转录反应体系见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T003表3反转录反应体系项目体积/µL条件Total RNA4.050 ℃、15 min85 ℃、5 s5×HiScript Ⅱ qRT Super Mix4.0RNase-free ddH2O12.01.6q-PCR检测引物参考GenBank ID: NC_037331.1、MK714346.1、NM_0174259.1、NM_001034034.1，使用Oligo 6软件设计，由大连TaKaRa公司合成，引物信息见表4。以GAPDH基因为内参基因进行qPCR扩增，扩增体系及条件，分别见表5、表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T004表4引物信息基因引物（5'→3'）退火温度/℃扩增长度/bpCD36F：TACAATAATACTGCGGATGG60169R：TCTCAACAAAAGGTGGAAATGAPDHF：ATGCTGGTGCTGAGTATG60173R：AATCTTGAGGGTGTTGT10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T005表5qPCR体系项目体积合计20.02×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix10.0Primer 10.4Primer 20.4Template cDNA1.0ddH2O8.2µL10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T006表6qPCR条件项目循环/次温度/℃时间/s预变性变性19530循环反应变性409510退火405130溶解曲线变性19560退火16060延伸195151.7数据统计与分析采用DNAMAN软件比对分析DNA序列，采用POPGENE 32.0软件计算基因型频率、有效等位基因数（Ne）、纯合度（Ho）、杂合度（He）、多态信息含量（PIC），SPSS 19.0软件统计分析基因型与生产性能的关联性，2-ΔΔCt法测算基因表达量。2结果与分析2.1血液DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果（见图1）经核酸蛋白测定仪检测，DNA的OD260/280值在1.8~2.0区间。由图1可知，经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA条带清晰且无拖尾现象，表明提取的DNA质量和纯度均较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.F001图1血液DNA琼脂糖凝胶电泳检测结果2.2PCR扩增及SSCP分型检测结果（见图2~图4）以血液DNA为模板，PCR扩增CD36基因exon 8，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。由图2可知，扩增片段与目的片段大小一致，特异性较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.F002图2exon 8琼脂糖凝胶电泳检测结果注：M为DNA marker，1~3为PCR产物由图3可知，SSCP检测PCR产物，发现存在2种基因型，分别命名为CC、CD。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.F003图3SSCP检测由图4可知，测序比对发现，exon 8的79 219 bp处发生C/A碱基突变，引起氨基酸变异，赖氨酸变成苏氨酸，属错义突变。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.F004图4测序结果及氨基酸变异2.3CD36基因遗传多态性分析（见表7、表8）由表7可知，C 79219 A位点中CC为优势基因型，频率为0.82；C为优势等位基因，其频率为0.91。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T007表7exon 8遗传多态性多态位点样本量/份基因型频率等位基因频率CCCDDDCDC 79219 A3400.820.1800.910.09由表8可知，C 79219 A位点的纯合度较高（Ho0.8），PIC值小于0.25，属低度多态。经哈代-温伯格平衡（χ2）检验，P值大于0.05，C 79219 A位点处于哈代-温伯格平衡状态，即在遗传过程中保持基因稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T008表8exon 8遗传变异参数项目多态位点纯合度（Ho）杂合度（He）有效等位基因数（Ne）多态信息含量（PIC）卡方检验（χ2）P值结果C 79219 A0.820.181.950.153.300.05注：高度多态PIC0.5，中度多态0.25PIC0.5，低度多态PIC0.25。2.4CD36基因遗传多态性与肉质性能相关性分析（见表9）由表9可知，C79219A位点中CD基因型宰前活重、肌内脂肪含量显著高于CC基因型（P0.05）；CD基因型的眼肌面积、胴体重高于CC基因型，但差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T009表9CD36基因遗传多态性与肉质性能相关性分析（18月龄）项目宰前活重/kg胴体重/kg屠宰率/%pH值背膘厚度/cm眼肌面积/cm3肌内脂肪/%剪切力/N失水率/%CC482.37±9.41b279.34±8.9457.61±3.595.64±0.361.35±0.7290.26±5.977.06±1.53b53.92±0.7230.28±1.39CD497.24±5.63a284.28±7.4557.25±2.165.73±0.281.37±0.4192.04±2.187.47±0.95a52.38±0.6632.16±0.71注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05），表10与此同。2.5RNA提取结果（见图5）由图5可知，经核酸蛋白测定仪检测，RNA的OD260/280值在1.8~2.0之间；1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，28S、18S、5S条带清晰且28S条带比18S明显亮，表明提取的RNA质量和纯度均较好，可用于qPCR试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.F005图5RNA提取结构2.6CD36 mRNA在不同基因型个体中的表达差异（见表10）由表10可知，CD型与CC型红牛腿肌、背最长肌、心脏、肝脏的CD36 mRNA表达量差异不显著，但CC型腿肌、背最长肌、肝脏中的mRNA表达量均高于CD型。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T010表10CD36 mRNA在不同基因型个体中的表达差异项目腿肌背最长肌心脏肝脏CC3.47±2.153.89±2.410.93±1.462.58±1.66CD1.00±1.591.00±1.161.00±0.551.00±0.992.7CD36 mRNA在不同组织的相对表达量（见表11）由表11可知，以肝脏的CD36 mRNA表达量为参照，分析不同组织的CD36 mRNA表达量差异。在CD型、CC型中，CD36 mRNA表达量从高到低排序为心脏、腿肌、背最长肌、肝脏。CD型中，心脏表达量显著高于肝脏（P0.05）；CC型中，心脏表达量极显著高于肝脏（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.07.018.T011表11CD36 mRNA在不同组织的相对表达量项目腿肌背最长肌心脏肝脏CD6.27±4.93ab5.82±2.81ab12.47±0.51a1.00±0.47bCC6.38±3.34B4.81±2.79B37.66±12.05A1.00±0.53B注：同行数据肩标大写字母不同表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论3.1CD36基因遗传特性分析CD36是一种跨膜糖蛋白，广泛分布于单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、心脏肌细胞等组织细胞表面，能与磺基-N-琥珀酰亚胺油酸酯发生特异性结合进而阻断脂肪酸的代谢[13]。在生物体内，CD36介导脂肪酸的跨膜运输，特别是长链脂肪酸的摄取，促进脂肪酸进入Krebs循环，减少脂肪沉积内脏，增加组织储存能量，进而影响机体代谢，若代谢紊乱会发生血管硬化、糖尿病、肥胖等疾病[14]。目前，已有关于畜禽CD36基因的研究。李万贵等[15]研究发现，樱桃谷鸭CD36基因exon 9中476593处发生T/C突变，肌内脂肪含量突变型明显低于野生型，血清生化指标突变型明显高于野生型，推测碱基突变引起了CD36基因活跃表达，加强了脂肪酸分解代谢。张松[16]研究发现，秦川牛CD36基因exon 8发生g.92968AG碱基替换突变（aa. AsnAsp），体斜长、眼肌深度和肌内脂肪含量不同基因型之间均存在显著差异，表明可以通过人工选择改变群体基因型频率提高秦川牛肉品质。王燕燕等[17]研究发现，早胜牛CD36基因exon 4发生g.70037GA碱基突变，胴体重、肌内脂肪含量突变型与野生型差异均显著，推测该基因具有作为提高肉质性状指标分子选择潜力。本研究分析了平凉红牛CD36基因exon 8遗传多态性及其与肉质性状的关联度发现，C 79219 A位点CC为优势基因型，C为优势等位基因，纯合度较高（Ho0.8），杂合度较低（He0.2），多态信息含量较低，属低度多态（PIC0.25）。经哈代-温伯格平衡检验，CD36基因处于哈代-温伯格平衡状态，即在遗传过程中保持着稳定；g. 79219 C A碱基突变引起氨基酸变异，赖氨酸变成苏氨酸，该突变对平凉红牛的生长发育及肉品质影响很大，CD基因型宰前活重、肌内脂肪含量、眼肌面积、胴体重高于CC基因型，推测CD36基因可能是影响肉品质的主效基因，突变可能使CD36基因表达量降低，脂肪酸分解代谢通路受阻，可以将该基因作为改善肉品质的候选分子标记。3.2CD36 mRNA在不同组织的相对表达分析CD36属B类清道夫受体，能够结合多种类型配体，参与机体的物质代谢、血管生成和免疫反应等生命活动[18-19]。研究发现，CD36在脂肪代谢过程中处关键位置，CD36胞内羧基端介导脂肪酸吸收和蛋白结合[20]，若代谢紊乱会引起血管硬化、糖尿病、肥胖等疾病发生。Love-Gregory等[8]发现，CD36突变蛋白影响人体的脂质代谢水平。Christiaens等[21]发现，CD36分子能够促进脂肪细胞分化成熟和脂肪合成，CD36基因沉默表达会引起前体脂肪细胞分化成熟受阻。王梦迪等[22]分析了德宏奶水牛乳脂率与CD36基因表达量的关联性发现，高乳脂率组的mRNA表达量极显著高于中、低乳脂率组，中乳脂率组极显著高于低乳脂率组，mRNA表达量与乳脂率呈极显著正相关，推测CD36基因mRNA高水平表达可提高水牛乳脂率。马悦[23]研究了牦牛不同泌乳阶段CD36基因mRNA的表达发现，随着泌乳的进行mRNA的表达有一个升高的趋势，后期极显著高于前期，推测CD36基因能促进乳腺组织吸收利用脂肪酸，提高乳品质。廖红海等[24]研究了山羊不同组织CD36基因mRNA表达，结果显示，在心脏、肝脏、脂肪和背最长肌中均表达，表达量从高到低依次为脂肪、背最长肌、肝脏、心脏。王单单[25]研究表明，CD36基因在鸭的不同组织中均表达mRNA，脂肪组织中mRNA较高，肌胃和脾脏中mRNA较低，mRNA表达量显著影响血清中甘油三酯、球蛋白等生理生化指标，CD36基因可能调控脂肪的合成代谢。本研究发现，CD36基因在腿肌、背最长肌、心脏、肝脏中均表达mRNA，表达量从高到低依次是心脏、腿肌、背最长肌、肝脏，心脏表达量显著高于肝脏，此外突变型mRNA表达量均低于野生型，表明CD36基因突变影响了机体的脂质代谢水平。这与上述报道结果相似，CD36基因在不同组织器官均表达mRNA，在脂肪代谢旺盛的组织器官表达量较高，该基因能够促进脂肪细胞分化成熟和脂肪合成，若碱基突变造成CD36基因沉默表达则会使脂肪酸转运利用受阻，引起血管硬化、糖尿病、肥胖或脂肪沉积等发生。因此，后续还需进一步深入研究CD36基因调控脂质代谢的机制，为改善平凉红牛肉质品质提供参考。4结论平凉红牛CD36基因exon 8检测出1个SNPs位点（g.79219 C/A, aa. Lys Thr），基因分型为CD和CC型，CD基因型宰前活重、肌内脂肪含量显著高于CC基因型，眼肌面积、胴体重高于CC基因型。CD36基因在不同组织器官中均表达mRNA，腿肌、背最长肌mRNA表达量较高，表明CD36基因对平凉红牛肉用性状影响较大，可作为改善肉品质的候选分子标记基因。