犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）是哺乳动物腺病毒属中感染范围最广、致病性最强的一种病毒，可感染多种哺乳动物[1-3]。根据分子生物学和血清学特性分为Ⅰ型犬腺病毒（CAV-1）和Ⅱ型犬腺病毒（CAV-2）等2个血清型。CAV-1于1925年首次被发现，1984年被我国首次分离，证实了我国犬中存在CAV-1的感染。CAV-1在临床中主要引起犬传染性肝炎以及狐狸脑炎[4]。1961年，Ditchfield等从患有喉气管炎的犬中首次分离到CAV-2，并命名为Toronto A26/61[5]。由于CAV-1与CAV-2在抗原结构、理化性质以及核苷酸序列等方面具有相似性，所以CAV-2最初被认为是CAV-1的变异株[6]，后来才被证实为一个独特的CAV血清型。感染CAV-2的犬主要表现为犬传染性喉气管炎和传染性肠炎，也可出现神经症状[7]。预防CAV最好的方法是定期进行免疫，目前大多是多联苗联合免疫的方法，多联苗中含有CAV-2弱毒株，免疫程序同犬瘟热等疫苗。目前国内拥有的CAV-2弱毒株大多为国外引进。本研究从辽宁省辽阳某犬专业合作社感染CAV的患犬气管分泌物中成功分离出1株CAV，进行分子生物学鉴定、病毒分离、电镜观察、病毒特异性鉴定和动物回归试验等对分离毒株的生物学特性及致病力等研究，为后续开展新型CAV疫苗的研制提供参考。1材料和方法1.1试验材料1.1.1病料辽宁省辽阳某犬专业合作社犬场出现犬传染性肝炎疑似症状（轻微腹泻）的幼犬1例。1.1.2细胞MDCK细胞购自中国兽医药品监察所。1.1.3试剂DMEM、新生牛血清购自GIBCO公司，Easy Pure Viral DNA/RNA Kit、EasyScript One-Step RT-PCR Super Mix购自北京全式金生物技术有限公司，犬细小病毒阳性血清（中和效价不低于1∶64）、犬瘟热病毒阳性血清（中和效价不低于1∶128）、犬腺病毒2型阳性血清（中和效价均不低于1∶128）、狂犬病病毒阳性血清（中和效价不低于40 IU/mL）均由辽宁益康生物股份有限公司提供。1.1.4仪器PCR仪购自BIO-RAD、电泳仪购自北京六一仪器厂、生物安全柜购自北京中科星宇商贸有限公司。1.2试验方法1.2.1病料组织采集及处理采集CAV-2阳性病犬肠管，按l g组织∶10 mL灭菌冷生理盐水放入组织搅拌机中，以10 000~12 000 r/min充分捣碎组织，反复在-15 ℃以下冻融3次后，用3层灭菌纱布过滤2次，收集滤液，并以12 000 r/min 4 ℃离心30 min，收集上清，加入过滤除菌的终浓度为1 000 IU/mL青霉素和1 000 mg/L链霉素，分装，-70 ℃以下贮存。1.2.2分子生物学鉴定和核苷酸序列分析利用犬腺病毒纤突蛋白基因的特异性引物（F：5'-CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC-3'，R：5'-CTTCG-TGTCCGCTTCATG-3'），常规方法对采集的病毒进行PCR鉴定，并将扩增产物送至宝生物（大连）有限公司进行测序，选取GenBank上登录的CAV参考序列，使用DNAStar生物软件进行核苷酸同源性分析和进化树构建。参考毒株信息见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.T001表1参考毒株信息Tab.1Information of reference strainsGenBank登录号分离地区分离年份血清型U77082加拿大1961CAV-2KF676978意大利2011CAV-2KU315335巴西2016CAV-2KU725673巴西2016CAV-2KY775393土耳其2018CAV-2MF356370意大利2017CAV-2MF356371意大利2017CAV-2KF727562中国上海2013CAV-2PCR反应体系：2×ES One-Step Reaction Mix 10μL、EasyScript One-Step Enzyme Mix 0.4 μL、F（10 μmo/L）0.5 μL、R（10 μmo/L）0.5 μL、模板2 μL、RNA-free H2O 6.6 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃ 5 min。1.2.3病毒分离取MDCK细胞消化培养，同时设不接毒的健康细胞对照。置于37 ℃含5% CO2培养箱培养观察2~3 d，当细胞病变（CPE）达到80%以上时收获培养物，进行鉴定。1.2.4病毒含量测定将毒种采用无血清DMEM细胞培养液作10倍系列稀释，取10-4~10-7等4个稀释度，分别接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔MDCK细胞培养板，每个稀释度接种8孔，每孔0.1 mL，同时设正常细胞对照8孔。置37 ℃、含5% CO2培养箱吸附1 h，每孔补加含4%新生牛血清的DMEM细胞培养液0.1 mL，置37 ℃、含5% CO2培养箱培养观察4 d。按Reed-Muench法计算细胞半数感染量（TCID50）。1.2.5病毒鉴定用MDCK细胞培养物经粗离心去除细胞碎片取上清，超速离心分离病毒，用缓冲液（如PBS）悬浮病毒，常规磷钨酸染色后作负染，之后进行电镜观察。1.2.6病毒特异性鉴定分别采用0.1 mL犬细小病毒（CPV）阳性血清、犬瘟热病毒（CDV）阳性血清、CAV阳性血清、狂犬病病毒（RABV）阳性血清和健康犬血清与病毒分离物0.1 mL在37 ℃中和1 h，接种已长成良好单层的MDCK细胞，同时设正常细胞对照、病毒对照和阴、阳血清对照各6孔，置37 ℃、含5% CO2培养箱中培养观察4 d。1.2.7鉴别检测应用CPV、犬副流感病毒（CPIV）、CDV、RABV特异性鉴定引物，采用PCR或RT-PCR方法进行鉴别检测。1.2.8病毒回归试验取2~3月龄CAV抗体阴性（SN1∶2）的健康幼犬4只，将病毒培养液稀释为105.0TCID50/mL，分别通过口服和滴鼻途径各接种2.0 mL，隔离饲养观察14 d，同时设置4只不接种对照犬，分别记录每组犬的临床表现。2结果与分析2.1分子生物学鉴定2.1.1PCR扩增结果（见图1）根据临床症状，初步诊断病犬为CAV感染。由图1可知，利用CAV纤突蛋白基因特异性引物，通过PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳得到大小为1 019 bp的特异性核酸片段，与预期片段大小相符，将其命名为CAV A22株。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.F001图1PCR扩增结果Fig.1PCR amplification results注 ： M为DNA Marker DL2000；1为CAV阳性对照；2为阴性对照；3为分离株。2.1.2病毒核苷酸序列测定和遗传演化分析（见图2、图3）利用CAV纤突蛋白基因特异性引物扩增后进行核苷酸序列测定。由图2、图3可知，通过生物学软件DNAstar进行核苷酸同源性比较和遗传进化分析，结果表明，分离株与GenBank上登录的国内外已发表CAV参考序列的核苷酸序列同源性最高达100.0%。CAV A22株基因序列与U77082、KF676978、KU315335、KU725673同源性均为100.0%，与KY775393、MF356370、MF356371的同源性分别为96.6%、99.7%和99.3%。由遗传进化树可以看出，分离株与加拿大分离株U77082亲缘关系较近，处于同一分支。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.F002图2分离株与其他毒株同源性比较Fig.2Homology comparison between isolate and other strainsXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.F003图3分离株犬2型腺病毒纤突蛋白基因遗传演化树Fig.3Genetic evolutionary tree of canine adenovirus type 2 spike protein gene2.2病毒分离结果（见图4）由图4可知，采用MDCK细胞接种CAV-2阳性病料的悬液后，F3代即出现了可见的细胞病变，细胞出现了聚集呈葡萄串状、折光性强的细胞病变。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.F004图4病毒分离结果Fig.4Virus isolation result2.3病毒含量测定结果F3代分离株病毒经病毒含量测定，按Reed-Muench法计算细胞TCID50为105.5TCID50/0.1 mL。2.4病毒形态观察结果（见图5）由图5可知，电镜观察可见20面体立体对称、无囊膜、直径约80 nm的典型病毒粒子，未见其他粒子。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.F005图5病毒形态观察结果Fig.5Morphological observation of virus2.5病毒特异性鉴定结果（见表2）由表2可知，除CAV抗血清未产生CPE外，CDV抗血清、CPV抗血清、RABV抗血清和健康犬血清组均产生了病毒分离时相同的CPE，表明所分离获得的病毒为CAV。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.T002表2病毒特异性鉴定结果Tab.2Result of virus specificity identification抗血清种类血清量/mL病毒量/mL37 ℃中和时间/hCPECAV阳性血清0.10.11—CDV阳性血清0.10.11+CPV阳性血清0.10.11+RABV阳性血清0.10.11+健康犬血清对照0.10.11+病毒对照—0.11+正常细胞对照————注 ：“+”表示出现CPE；“-”表示无CPE。2.6鉴别检测（见图6、图7）由图6、图7可知，对F3代毒种进行CPV、CAV、CDV、CPIV和RABV的PCR检测结果均呈阴性，对照全部成立，说明本毒种无外源病毒污染。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.F006图6F3代CAV、CPV的PCR扩增结果Fig.6PCR amplification results of F3 CAV and CPV注 ： M为DNA Marker DL2000；1为CAV阳性对照；2为阴性对照；3为被检样品；4为CPV阳性对照；5为阴性对照；6为被检样品。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.004.F007图7F3代CDV、CPIV、RABV的RT-PCR扩增结果Fig.7RT-PCR amplification results of F3 CDV, CPIV and RABV注 ： M为DNA Marker DL2000；1为CDV阳性对照；2为阴性对照；3为被检样品；4为CPIV阳性对照；5为阴性对照；6为被检样品；7为RABV阳性对照；8为阴性对照；9为被检样品。2.7动物回归试验2~3月龄犬腺病毒抗体阴性（SN1:2）健康幼犬4只，分别通过口服和滴鼻途径各接种2.0 mL（病毒培养液稀释为105.0TCID50/mL），饲养观察至5、9、14 d时，3只接种犬先后出现轻微腹泻，并有轻度发热，病程持续2 d后康复；另1只攻毒犬和4只对照犬均未发病，未发生死亡现象。结果表明，本株CAV致病力较弱，加以驯化可成为一株良好的疫苗毒株。3讨论犬传染性肝炎主要发生在1岁以内的幼犬，发病率和病死率均较高，成年犬很少发病且多为隐性感染，即使发病也多能耐过，病犬和带毒犬是主要传染源。病犬的分泌物、排泄物均含有病毒，康复带毒犬可从尿中长时间排毒。CAV主要经消化道感染，也可能经胎盘感染。犬传染性肝炎发生无明显季节性，以冬季多发。自然感染犬传染性肝炎的犬潜伏期7 d左右，最急性病例出现呕吐、腹痛、腹泻症状后数小时内死亡；急性病例精神沉郁、寒战怕冷、体温升高至40.5 ℃左右，食欲废绝、喜喝水，呕吐、腹泻等；亚急性病例症状反应较轻。上述症状外，还可见贫血、黄疸、咽炎、扁桃体炎、淋巴结肿大，特征性症状是角膜水肿、混浊、角膜变蓝，故临床上也称“蓝眼病”。1975年，研究人员用CAV-2进行免疫试验，结果发现CAV-2弱毒疫苗能够保护犬抵抗CAV-1、CAV-2的感染，激发体液免疫和细胞免疫[8-11]。目前世界上所用的CAV疫苗均为CAV-2弱毒疫苗[5,12-13]，使得相关疾病得到了有效控制，在免疫犬中未发现CAV-2感染[14-15]。本研究从发病犬中成功分离到1株CAV-2，命名为CAV A22株，该毒株的主要抗原基因与加拿大流行的CAV-2毒株（U77082）差异较小，亲缘关系较近，处于同一分支，与我国上海地区流行株差异相对较大。推测导致不同流行毒株之间差异的重要原因可能与区域环境适应有关。综上所述，本研究丰富了我国CAV流行病学调查资料及毒种资源，有助于了解本地区CAV的遗传变异规律，为后续开展新型CAV疫苗的研制奠定了基础。4结论本研究成功分离到1株CAV-2，命名为CAV A22株，通过遗传进化分析与加拿大流行的CAV-2毒株（U77082）处于同一分支。该毒株纯净、特异、无外源病毒污染，对细胞和试验犬均具有一定的感染性和致病力，后续将进行系统的免疫原性等研究，为产业化应用提供数据支持。