葡萄球菌是医学和兽医临床中常见的病原菌，广泛分布于自然界，如水、空气、土壤、饲料和一些物品中。葡萄球菌也可寄生在人和动物的皮肤、黏膜，绝大多数为人体表常在菌，少数菌对人和动物具有一定致病性，如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等。葡萄球菌能够引起人类和多种动物发病，如皮肤脓肿、乳房炎和子宫内膜炎等，是一种重要的人畜共患条件致病菌[1-2]。目前，对动物源葡萄球菌的研究主要集中在超级耐药菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）[3]。但越来越多的葡萄球菌属成员分离自人和动物，并且可导致人类相关疾病[4-5]。如迟缓葡萄球菌（Staphylococcus lentus）[6]分离自刺猬、牛和山羊奶中，松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）在猴子、鲸类、牛、羊、马和狗等动物中被分离[7-8]，小牛肉葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus）可在牛肉中分离得到[9]。上述葡萄球菌均为凝固酶阴性葡萄球菌（coagulase negative Staphilococcus，CoNS），致病力比金黄色葡萄球菌弱，但在一定条件下也可使宿主发病，并且增加致病细菌传播的可能性[10]。小牛肉葡萄球菌是一种少见的条件致病菌，通常与动物或动物源性制品有关[11-12]，如奶酪[1]、零售鸡肉[13]等，也有报道称可从患者血液中分离出该种细菌[14]。本试验从塔额垦区某羊场病死羊的肺脏和淋巴结组织中分离并鉴定4株小牛肉葡萄球菌，并对分离株进行药物敏感试验，以期为小牛肉葡萄球菌的防治提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1样品采集无菌采集塔额垦区某养殖场病死羊肺脏和淋巴结组织样品9份，于-20 ℃保存。金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）由新疆生产建设兵团塔里木动物疫病诊断与防控工程实验室保存。1.1.2试验仪器SW-CJ-1F超净工作台（上海博讯实业有限公司）；移液器（Eppendorf公司）；DHP-0982恒温培养箱（上海智城分析仪器制造有限公司）；高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama会社）；PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪（Bio-Rad公司）。1.1.3培养基及试剂培养基：脑心浸液肉汤培养基（BHI）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）、Mueller- Hinton琼脂培养基（青岛海博生物有限公司）；药敏片（温州市泰康生物科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1细菌分离、鉴定使用无菌水冲洗病料组织2~3次，剪取内部组织于BHI液体培养基中37 ℃过夜增菌培养，之后划线于BHI固体平板上，置37 ℃培养18~24 h，划线纯化1~2次。观察各平板上细菌菌落大小及形态，挑取单菌落进行革兰氏染色、镜检。1.2.2生化试验将纯培养的菌株进行触酶试验[15]、血浆凝固酶试验、甘露醇发酵试验、溶血试验。1.2.316S rRNA基因扩增（见表1）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.001.T001表116S rRNA基因引物序列Tab.1Primer sequence of 16S rRNA gene基因名称引物序列（5'→3'）片段大小/bp16S rRNA5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3'1 4655'-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3'挑取纯化的单个菌落于TSB液体培养基中，37 ℃培养12 h。于超净工作台中吸取菌液2 mL置于新的离心管内，按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取细菌DNA。以细菌DNA为模版，采用细菌通用引物16S rRNA基因进行PCR扩增。PCR扩增体系（25 µL）：2×SanTaq PCR Mix 12.5 µL、25 µmol/L上游引物0.5 µL、25 µmol/L下游引物 0.5 µL、ddH2O 10.5 µL、模板DNA 1 µL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30个循环；72 ℃总延伸10 min。取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物送至上海生工生物工程技术有限公司进行双向测序。基因序列在Gen Bank数据库（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）中进行比对，鉴定细菌种类。1.2.4药敏试验采用K-B纸片法对鉴定为小牛肉葡萄球菌的菌株进行药物敏感性检测，按美国临床和实验室标准协会指南（CLSI）标准操作。在MHB中37 ℃条件下培养6~8 h的细菌混悬液，用无菌水稀释至0.5个麦氏标准，使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于MHA上，贴药敏片，同时使用标准金黄色葡萄球ATCC 25923作为质控菌株。质控菌株抑菌圈直径在质控范围内可对待测菌株进行药物敏感试验结果判定。2结果与分析2.1分离株的培养鉴定结果4株分离株在BHI培养基上长出边缘整齐、圆形、光滑湿润的不透明黄色菌落。挑取单个菌落进行纯培养后，对分离菌进行革兰染色镜检，结果见图1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.001.F001图1分离株革兰染色镜检结果Fig.1Results of gram stain microscopy of isolated strain由图1可知，分离株呈蓝紫色、葡萄串状球菌，为革兰阳性。2.2分离株生化试验结果（见表2）对分离得到的4株分离株（F1-1-2、L4-1-1、L7-3-2和L9-4）进行生化鉴定，结果见表2。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.001.T002表2分离株生化试验结果Tab.2Results of biochemical tests of isolated strain菌株F1-1-2L4-1-1L7-3-2L9-4触酶试验----血浆凝固酶试验----甘露醇发酵试验--++溶血试验----注 ：“-”表示阴性反应；“+”表示阳性反应由表2可知，4株葡萄球菌中的2株菌发酵甘露醇，4株分离株触酶试验、血浆凝固酶试验和溶血试验均为阴性。2.3分离株16S rRNA基因扩增及同源性分析结果（见图2）由图2可知，分离株用细菌16S rRNA基因通用引物扩增出大约为1 465 bp左右的目的基因条带。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.001.F002图2分离株16S rRNA基因电泳结果Fig.2Electrophoresis results of 16S rRNA gene of isolated strain注 ： M为Marker DL2000；1~4为分离株。分离株的PCR产物测序结果与GenBank中登录的参考菌株的基因序列相似性在99%~100%之间，从分子生物水平证实了4株分离株均为小牛肉葡萄球菌。2.4分离株药敏试验结果（见表3）XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.001.T004抗生素菌株F1-1-2L4-1-1L7-3-2L9-4四环素类替加环素SRSS恶唑烷酮类利奈唑胺RSRS利福霉素类利福平SSRS大环内酯类红霉素SSRS氯霉素类氟苯尼考SSRS磺胺类复方新诺明SSRS多肽类多黏菌素BSSSR林可酰胺类克林霉素RSRR注 ：S表示敏感；I表示中介；R表示耐药由表3可知，3株菌对青霉素、替米考星、恩诺沙星和克林霉素耐药，1株菌对诺氟沙星、利福平、红霉素、氟苯尼考、复方新诺明耐药，4株菌对头孢噻呋钠和头孢西丁均敏感，4株小牛肉葡萄球菌中有3株是多重耐药菌。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.001.T003表3分离株药敏试验结果Tab.3Results of drug sensitivity test of isolated strain抗生素菌株F1-1-2L4-1-1L7-3-2L9-4β-内酰胺类头孢噻呋钠SSSS头孢西丁SSSS青霉素RSRR氨苄西林RSRS氨基糖苷类庆大霉素RSRI替米考星RSRR阿米卡星SSIR喹诺酮类诺氟沙星SSRS恩诺沙星RSRR续表3　分离株药敏试验结果（Continued）Tab.3　Results of drug sensitivity test of isolated strain3讨论葡萄球菌分为致病性和条件致病性，触酶试验、甘露醇发酵试验、凝固酶试验结果呈阳性和具有溶血能力的葡萄球菌往往被认为是具有较强致病力的菌株，如金黄色葡萄球菌。小牛肉葡萄球菌是一种凝固酶阴性的葡萄球菌，目前国内外关于小牛肉葡萄球菌的报道少。有研究表明，小牛肉葡萄球菌可从人的血液中分离得到[16]。本研究中，塔额垦区某养殖场内有羊出现呼吸道疾病，且在9份样品中分离出4株小牛肉葡萄球菌，因此小牛肉葡萄球菌的防治应引起注意。本研究通过对从病死羊的组织中分离鉴定出4株分离株进行生化鉴定和16S rRNA基因序列比对分析，结果显示，这4株小牛肉葡萄球菌均为触酶试验、凝固酶试验结果阴性且无溶血能力，但有2株为甘露醇发酵阳性菌株，并且为多重耐药菌株，原因可能是在疾病的发生发展过程中，分离株作为条件致病菌存在，在机体免疫力下降的情况下使机体继发感染。因此，小牛肉葡萄球菌可能是该羊场羊发病的病原菌之一，但未能排除不可培养病原或难培养病原，如病毒感染或支原体感染等导致发病的可能。本研究中的药敏试验结果表示，4株小牛肉葡萄球菌中有3株为多重耐药菌株，除了对头孢噻呋钠和头孢西丁均敏感外，对其余15种药物均呈不同程度的耐药。结果表明，本试验分离的小牛肉葡萄球菌与其他凝固酶阴性的葡萄球菌一致[17]，对多种抗生素耐药。细菌的耐药性问题是世界公共卫生关注的重点问题之一，国内动物源性葡萄球菌的耐药率随着地区和宿主动物的不同而存在很大差异，对青霉素类的耐药率可达38%~90%，且对磺胺类、四环素类、大环内酯类等多种药物存在不同程度的多重耐药情况[18-21]。因此，研究小牛肉葡萄球菌可能会引发的疾病以及跨物种传播导致耐药基因水平传播，进而造成的潜在公共卫生威胁很有必要。4结论本研究通过对4株羊源病料组织中分离得到的小牛肉葡萄球菌进行生理生化和药物敏感性检测，推测其可能是导致羊场发病的病原菌之一。通过药敏试验结果建议选取头孢噻呋钠、头孢西丁等药物防控小牛肉葡萄球菌的感染，为小牛肉葡萄球菌的防治补充基础试验数据。