辣蓼（Polygonum hydropiper L.）为一年生草本植物，属蓼科（Polygonaceae）蓼属（Polygonum L），是一种资源十分丰富的植物[1]。辣蓼中的主要活性成分为芦丁、槲皮素、槲皮苷、金丝桃苷等黄酮类化合物[2]。其中黄酮类化合物是传统中草药中常见的活性成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、调节免疫力、抗应激、抗炎以及抗肿瘤等作用。但大多数黄酮类活性成分因溶解度不高、稳定性低、吸收差、生物利用度低等限制了其制剂开发与临床应用[3]，而脂质体载体可很好地解决这些问题。脂质体（直径通常为100~500 nm）由磷脂自组装制成，磷脂由极性磷酸酯头基和疏水性脂质尾组成[4]。脂质体的脂质成分主要源自鸡蛋或大豆卵磷脂的磷脂酰胆碱[5]。药物分子在脂质体环境中的位置不同，并且根据溶解度和分配特性表现出不同的截留和释放特性[6]。亲脂性药物通常包埋在脂质体的脂质双层中，很少遇到如储存过程中丢失包埋药物的问题[7]。亲水性药物可能被包裹在脂质体的水核内或位于外部水相中[8]。普通脂质体稳定性较差，可被网状内皮系统吞噬（reticuloendothelial system，RES）影响药物的生物利用度[9]。聚乙二醇（PEG）化脂质体通常被称为“隐形”脂质体，与普通纳米脂质体相比更能够逃脱RES的识别，以增加在体内的循环时间[10]。本试验采用改良乙醇注入法制备辣蓼黄酮长循环脂质体，并通过单因素和响应面试验优化制备条件，采用后插入法制备长循环脂质体，为应用辣蓼黄酮防控动物疾病提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验试剂辣蓼黄酮（广西大学药理与病理实验室）、大豆卵磷脂（纯度≥98%，上海艾伟拓医药科技有限公司）、芦丁标准品（纯度≥98%，批号：1103M028，北京索莱宝科技有限公司）、胆固醇（纯度≥99%，批号：C10780，上海艾伟拓医药科技有限公司）、PBS磷酸盐缓冲液（0.01 mol/L，pH值7.2~7.4，北京索莱宝科技有限公司），吐温80、无水乙醇、甲醇和NaCl试剂等均为国产分析纯；透析袋MD34（8 000~14 000，北京索莱宝科技有限公司）、DSPE-MPEG 2000（纯度≥99%，批号：C00486，上海艾伟拓医药科技有限公司）。1.1.2试验仪器HEI VAP ADVANTAGE旋转蒸发仪（德国海道夫公司）、UV-1800紫外可见光分光光度计（岛津（苏州）仪器有限公司）、Zetasizer Nano-ZS纳米粒度电位分析仪（英国Malvern instrument lid）、SCIENTZ-IID超声波细胞粉碎仪（宁波新芝生物科技股份有限公司）、HH-4数显恒温水浴锅（常州澳华仪器有限公司）、524G恒温磁力搅拌器（上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司）、CF16RN Himac多用途冷冻离心机（广西南宁博美生物科技有限公司）。1.2试验方法1.2.1辣蓼黄酮长循环纳米脂质体制备方法的筛选1.2.1.1改良乙醇注入法设磷胆比5∶1、药脂比1∶10、吐温80浓度6 g/L，加无水乙醇超声溶解。用注射器缓慢滴入预热的生理盐水中，边滴边搅拌，置于磁力搅拌器上300 r/min搅拌3.5 h，并45 ℃旋转蒸发。结束后用细胞破碎仪超声10 min即得淡黄色澄清透明的辣蓼黄酮脂质体。称取一定量的DSPE-MPEG 2000加入，置于磁力搅拌器50 ℃、100 r/min搅拌1 h，即得到辣蓼黄酮长循环纳米脂质体，测定辣蓼黄酮纳米脂质体包封率（EE）。EE=W包/W总×100%（1）式中：W包表示透析后纳米脂质体内包裹辣蓼黄酮的质量；W总表示辣蓼黄酮的总质量。1.2.1.2薄膜分散法设磷胆比5:1、药脂比1:10、吐温80浓度6 g/L，加无水乙醇超声溶解，45 ℃旋转蒸发，倒入提前预热好的生理盐水，常压旋转水合10 min。结束后用细胞破碎仪超声10 min即得淡黄色澄清透明的辣蓼黄酮脂质体。称取一定量的DSPE-MPEG 2000加入，置于磁力搅拌器50 ℃、100 r/min搅拌1 h，即得到辣蓼黄酮长循环纳米脂质体，测定辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.1.3逆向蒸发法设磷胆比5∶1、药脂比1∶10、吐温80浓度6 g/L，加入无水乙醇超声溶解。加入生理盐水经过充分的超声振荡形成W/O乳状液体，45 ℃旋转蒸发。结束后用细胞破碎仪超声10 min即得淡黄色澄清透明的辣蓼黄酮脂质体。称取一定量的DSPE-MPEG 2000加入，置于磁力搅拌器50 ℃、100 r/min搅拌1 h，即得到辣蓼黄酮长循环纳米脂质体，测定辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.1.4普通乙醇注入法设磷胆比5∶1、药脂比1∶10、吐温80浓度6 g/L，加无水乙醇超声溶解。用注射器缓慢滴入预热的生理盐水中，边滴边搅拌，置于磁力搅拌器上300 r/min搅拌4.5 h。结束后用细胞破碎仪超声10 min即得淡黄色澄清透明的辣蓼黄酮脂质体。称取一定量的DSPE-MPEG 2000加入，置于磁力搅拌器50 ℃、100 r/min搅拌1 h，即得到辣蓼黄酮长循环纳米脂质体，测定辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.2辣蓼黄酮纳米脂质体EE测定1.2.2.1芦丁全波长扫描配制100 mg/L的芦丁标准品溶液在300~500 nm处进行全波长扫描。1.2.2.2标准曲线建立以芦丁为对照品检测辣蓼黄酮的含量，将10 mg标准品溶于10 mL无水乙醇配制成1 000 mg/L的储备液，分别稀释成5、10、20、40、60、80、100 mg/L的标准品溶液。以浓度为横坐标（x），吸光度为纵坐标（y），在360 nm波长下检测吸光度。1.2.2.3辣蓼黄酮纳米脂质体EE的测定采用透析法测定辣蓼黄酮纳米脂质体EE。精密量取纳米脂质体混悬液1 mL置于透析袋中，浸入pH值7.2~7.4的PBS磷酸缓冲液500 mL中，置于磁力搅拌器搅拌6 h，3 h换一次透析介质。分别取透析后的纳米脂质体和未透析的纳米脂质体各1 mL置于10 mL离心管中，加入4 mL甲醇超声振荡破乳，于360 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算辣蓼黄酮含量，计算辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.3制备工艺的单因素考察1.2.3.1磷胆比的选择采用改良乙醇注入法制备，固定药脂比为1∶10、生理盐水10 mL水化、制备温度45 ℃、吐温80 100 g/L、无水乙醇5 mL。分别考察磷胆比3∶1、5∶1、7∶1、9∶1条件下辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.3.2药脂比的选择采用改良乙醇注入法制备，固定磷胆比7:1、生理盐水10 mL水化、制备温度45 ℃、吐温80 100 g/L、无水乙醇5 mL。分别考察药脂比1∶6、1∶10、1∶14、1∶18条件下辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.3.3生理盐水的体积采用改良乙醇注入法制备，固定磷胆比7∶1、药脂比1∶10、制备温度45 ℃、吐温80 100 g/L、无水乙醇5 mL。分别考察生理盐水体积7、10、13、16 mL条件下辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.3.4超声时间的选择采用改良乙醇注入法制备，固定磷胆比7∶1、药脂比1∶10、生理盐水10 mL水化、制备温度45 ℃、吐温80 100 g/L、无水乙醇5 mL。分别考察超声时间4、6、8、10、12 min条件下辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.3.5表面活性剂的用量采用改良乙醇注入法制备，固定磷胆比7∶1、药脂比1∶10、生理盐水10 mL水化、制备温度45 ℃、无水乙醇5 mL。分别考察吐温80浓度2、4、6、8、10 g/L条件下辣蓼黄酮纳米脂质体EE。1.2.4辣蓼黄酮纳米脂质体的Box-Behnken响应面试验在单因素试验的基础上选择3个对EE影响较大的因素（磷胆比、药脂比、生理盐水体积）进行3因素3水平响应面试验，从而选择最优条件。根据最优条件重复制备辣蓼黄酮脂质体，测定EE。响应面试验因素水平见表1。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.T001表1Box-Behnken响应面试验因素与水平Tab.1Box-Behnken response surface test factors and levels水平因素A磷胆比B药脂比C生理盐水体积/mL-15∶11∶6707∶11∶101019∶11∶14131.2.5纳米脂质体粒径、多分散性指数（PDI）、Zeta电位的测定将制备好的辣蓼黄酮纳米脂质体进行两倍稀释，采用马尔文纳米粒度电位分析仪测定。1.2.6DSPE-MPEG 2000用量的确定根据最优处方制备辣蓼黄酮纳米脂质体后，分别加入DSPE-MPEG 2000与卵磷脂摩尔比例为4%、5%、6%、7%、8%的DSPE-MPEG 2000。之后置于磁力搅拌器50 ℃、100 r/min搅拌1 h，即得到辣蓼黄酮长循环纳米脂质体。测定辣蓼黄酮长循环纳米脂质体的EE、粒径、多分散性指数（PDI）和Zeta电位。2结果与分析2.1紫外分光光度法测定芦丁含量的标准曲线（见图1）由图1（a）可知，芦丁在300~500 nm进行全波长扫描，在360 nm处出现最高吸收峰。图1芦丁全波长扫描及标准曲线Fig.1Full wavelength scanning and standard curve of rutinXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F1a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F1a2由图1（b）可知，以浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标绘制的回归方程为：y=0.011 6x+0.004 8，R2=0.999 3。表明芦丁在5~100 mg/L内线性关系良好。2.2辣蓼黄酮长循环纳米脂质体制备方法的筛选（见表2）由表2可知，通过改良乙醇注入法制备的辣蓼黄酮纳米脂质体EE最高，达到了61.64%，普通乙醇注入法EE为55.23%，薄膜分散法EE为49.16%，逆向蒸发法EE最低，为36.54%。选用改良乙醇注入法进行后续研究，并进一步优化条件。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.T002表2不同制备方法对辣蓼黄酮纳米脂质体EE的影响Tab.2Effect of different preparation methods on EE nano liposome of Polygonum spicum flavone方法EE改良乙醇注入法61.64薄膜分散法49.16逆向蒸发法36.54普通乙醇注入法55.23%2.3单因素对辣蓼黄酮纳米脂质体包封率的影响（见图2）由图2（a）可知，磷胆比对EE的影响较大。磷胆比在3∶1~7∶1范围内呈上升趋势，在7∶1~9∶1范围内呈下降趋势，在7∶1时EE最高，达69.44%。图2单因素对辣蓼黄酮纳米脂质体EE的影响Fig.2Effect of single factor on EE nano liposome of Polygonum flavoneXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F2a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F2a2XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F2a3XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F2a4XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F2a5由图2（b）可知，药脂比在1∶6~1∶18范围内时，EE呈先上升后下降的趋势，其中在1∶10~1∶18范围内下降明显，在1∶10时达到最高，为65.96%。由图2（c）可知，生理盐水体积在7~13 mL范围内时，EE呈上升趋势，在13~16 mL范围内呈下降趋势，在生理盐水体积13 mL时最高，达69.81%。由图2（d）可知，超声时间在4~8 min范围内时，EE呈上升趋势，8~12 min范围内呈下降趋势，在超声时间8 min时最高，达到了68.62%。由图2（e）可知，在表面活性剂吐温80浓度在4~10 g/L范围内时，EE呈先下降后上升的趋势，在10~12 g/L范围内呈下降趋势，在表面活性剂浓度10 g/L时最高，达到65.42%。2.4辣蓼黄酮脂质体的响应面试验结果2.4.1响应面试验结果及方差分析（见表3、表4）由表3可知，以包封率为响应值，磷胆比（A）、药脂比（B）、生理盐水体积（C）为自变量，得到自变量与响应值之间的回归方程为：Y=70.79-0.895 0A+0.083 7B-1.57C+2.78AB+1.94AC-2.80BC-5.05A2-2.20B2-5.18C2XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.T003表3响应面试验结果Tab.3Response surface test results序号ABCEE/%100070.8921-1058.98300070.544-10156.93500070.10610160.0070-1-161.888-10-165.009-1-1067.31100-1165.391101159.341211065.321301-167.031400071.541510-160.321600070.8617-11062.54根据表4的回归模型方差分析可知，F值为47.46，而且P值0.000 1，差异显著。在失拟项检验中F值为5.88，P值为0.0600，差异不显著。该模型的相关系数（R2）为0.983 9，回归模型可说明响应值与反应参数的关系，表明该模型能够被用作改良乙醇注入法制备辣蓼黄酮纳米脂质体的工艺分析及预测。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.T004表4回归模型方差分析Tab.4Analysis of variance of regression model方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型368.21940.9147.460.000 1显著A6.4116.417.430.029 5B0.056 110.056 10.065 10.806 0C19.75119.7522.910.002 0AB30.86130.8635.800.000 6AC15.02115.0217.420.004 2BC31.36131.3636.380.000 5A2107.291107.29124.460.000 1B220.39120.3923.650.001 8C2112.781112.78130.830.000 1残差6.0370.862 1失拟项4.9231.645.880.060 0不显著纯误差1.1240.279 0总变异374.24162.4.2响应面分析和条件优化通过design-expert12绘制3种因素与响应值的三维曲面图和二维等高线图，结果见图3。由图3可知，3种因素均增加时，EE呈先上升后下降的趋势。辣蓼黄酮纳米脂质体的最优制备条件为磷胆比6.8∶1、药脂比1∶10.3、生理盐水体积9.5 mL。图3各因素对辣蓼黄酮纳米脂质体EE的影响Fig.3Effects of various factors on EE nano liposome of Polygonum spicum flavoneXX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F3a1XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F3a2XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F3a32.4.3辣蓼黄酮纳米脂质体最优条件的验证通过对上述试验得到的最优制备条件进行可行性验证，重复制备3批辣蓼黄酮纳米脂质体的平均EE为（71.29±1.12）%，平均粒径为（68.68±0.33） nm，平均PDI为0.146±0.010，平均电位为（-1.850±0.397） mV。2.5DSPE-MPEG 2000用量的确定（见图4）由图4可知，当DSPE-MPEG 2000与磷脂摩尔比在5%时，辣蓼黄酮长循环纳米脂质体的EE最高，达到了75.16%。DSPE-MPEG 2000与磷脂摩尔比为5%~7%时呈下降趋势，虽然在8%时EE有一些上升，但是浮动不大。XX.XXXX/j.issn.1672-9692.2023.04.005.F004图4DSPE-MPEG 2000与大豆卵磷脂摩尔比对辣蓼黄酮纳米脂质体EE的影响Fig.4Effect of DSPE-MPEG 2000 on molar ratio of soybean lecithin to Polygonum spicum flavone nanoliposome EE2.6辣蓼黄酮长循环脂质体最优条件的验证在摩尔比为5% DSPE-MPEG 2000时重复制备3批辣蓼黄酮长循环纳米脂质体，测得平均EE为（72.60±2.44）%，粒径为（80.93±0.30） nm，PDI为0.14±0.01，Zeta电位为（-1.70±0.29） mV。3讨论黄酮类化合物又称黄碱素，是一类重要的天然有机化合物，自然界中广泛存在[11]。黄酮类化合物不仅种类繁多，而且生理活性多种多样，如清除自由基、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗骨质疏松等[12-14]。本研究通过改良乙醇注入法成功制备辣蓼黄酮长循环纳米脂质体，在普通乙醇注入法的基础上加入了旋转蒸发和细胞破碎仪超声两个步骤，得到EE较高、粒径较小且分布均匀的脂质体。赵凯燕[15]用乙醇注入法制备蛇床子素脂质体，平均EE为（82.12±0.26）%，平均粒径为122.9 nm，EE和粒径远优于薄膜分散法，与本研究结果一致。郝静梅等[16]也采用乙醇注入法制备了柠檬烯纳米脂质体，但是其平均EE为（67.44±0.58）%，平均粒径为（165.40±2.08） nm，结果低于本研究，究其原因可能是本试验通过增加了旋转蒸发和细胞破碎仪超声两个步骤，提高了脂质体EE，减小了脂质体粒径。有文献报道，脂质体的粒径是决定其稳定性和生物体内应用的关键参数[17]，而且粒径过大的单室脂质体存在稳定性差、粒径大小不均等问题。通常脂质体的粒径越小，脂质体越稳定[18]。卢艳风[19]采用薄膜分散法制备芦丁脂质体，平均EE只有66.7%，而平均粒径达到了147.2 nm。陈浩[20]成功制备出槲皮素脂质体，但粒径达到了272 nm。本试验采用改良乙醇注入法制备出的长循环脂质体平均粒径为（80.93±0.30） nm。纳米脂质体粒径的大小还直接影响载体是否能够顺利进入组织和细胞发挥作用[21]，如穿透血脑屏障时，粒径太大就会影响效果。本研究中DSPE-MPEG 2000添加量与卵磷脂摩尔比例选择Paolino等[22]的试验中得出的4%、5%、6%、7%、8%。DSPE-PEG 2000不能以超过10%的摩尔比包含在DSPE/DSPC中，而且摩尔比增加会阻止其包含在脂质双层中，并且还会与其他磷脂一起形成混合胶束，使长循环纳米脂质体引起去聚乙二醇化。杨秀春等[23]采用5%的DSPE-MPEG 2000制备呋喃二烯长循环脂质体，EE高达90%，而当继续增加用量时，EE变化不是很明显。张文娟[24]成功制备了二氢杨梅素长循环脂质体，其中DSPE-MPEG 2000的加入量是5%时EE最高。上述研究结论与本研究结果一致，DSPE-MPEG 2000与磷脂摩尔比在5%时，EE为75.16%，增加用量EE明显下降。与普通辣蓼黄酮长循环脂质体相比，加入了DSPE-PEG 2000成为长循环脂质体后粒径有所增加，可能是PEG长链在脂质体表面形成了一层水化膜的缘故[25]。4结论本研究优选改良乙醇注入法为辣蓼黄酮长循环纳米脂质体最优的制备方法。通过单因素试验和响应面试验得出辣蓼黄酮纳米脂质体的最优条件为磷胆比6.8∶1、药脂比1∶10.3、生理盐水体积9.5 mL。选择摩尔比为5%的DSPE-MPEG 2000成功制备的辣蓼黄酮长循环纳米脂质体的EE最高，为（72.60±2.44）%，脂质体粒径为（80.93±0.30） nm，PDI为0.14±0.01，Zeta电位（-1.70±0.29） mV。本试验优化了辣蓼黄酮长循环纳米脂质体的制备条件，为辣蓼黄酮长循环纳米脂质体的开发和应用奠定了基础。