动物源性成分广泛分布于食品、饲料、化妆品等，与人们的生活息息相关，其中食品和饲料所占比例最大[1]。动物源性饲料作为动物食物链的中间环节，存在诸多不安全因素及潜在危险[2]。含牛羊源性成分的动物源性饲料的使用，一直被认为是疯牛病传播的主要途径[3]。目前，饲料中动物源性成分鉴别的主要方法有化学、色谱层析、免疫学和分子生物学方法。其中，以分子生物学为基础的多重实时荧光定量PCR成为检测的重要工具，但每种方法都有一定的局限性[4]。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplifi-cation，LAMP）是日本学者Notomi等在21世纪初建立的一种新的核酸等温扩增技术[5]。杨丽霞等[6]建立鸡、鸭源性成分的特异性基因LAMP可视化快速检测方法，最低检出限为1 pg。Wang等[7]应用LAMP技术研究鉴别马肉的比色检测方法，可在1 h内快速鉴定异种肉源中0.1%的马肉污染，而且没有发现假阳性信号。LMAP技术具有快速高效、特异性强、灵敏度高等特点[8]。微流控芯片技术具有将化学和生物学实验室的基本功能微缩到一个几平方厘米大小芯片上的能力，实现从样品处理到检测的微型化、自动化、集成化及便携化[9]。目前，微流控技术已在水产品检测[10]、食源性致病菌检测[11]、农药残留检测[12]、自然水体检测[13]等领域应用，但将LAMP和微流控技术相结合应用于饲料中动物源性成分检测尚未见报道。试验以牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉为研究对象，将LAMP技术和微流控技术相结合，开发饲料中肉源性成分检测芯片，以期为饲料中动物源性成分检测提供新方法，为饲料产品质量安全提供保障。1材料与方法1.1试验原料肉牛肉（吉林省长春皓月清真肉业股份有限公司）；羊肉（长春市清真寺附近羊肉专业直销市场）；猪肉、鸡肉、鸭肉（长春市农贸市场）；狐狸肉（吉林左家特产研究所）；马肉（九台农贸市场）；鼠肉、兔肉、狗肉、驴肉、鸽子肉、鹅肉、貂肉（双阳特种动物养殖基地）。1.2化学试剂与仪器设备试剂：Takara9765核酸提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；LAMP法DNA扩增试剂盒、荧光染料购自日本荣研化学株式会社；氯化锰、硫酸镁、氯化钾、氢氧化钠、EDTA、硫酸铵购自国药集团化学试剂有限公司。仪器设备：LA-320C型实时浊度仪（日本荣研化学株式会社）；RTisochipTM-B恒温扩增微流控芯片核酸分析仪、NanoQ型分光光度计（北京博奥晶典生物技术有限公司）；HB-2恒温震荡金属浴（威泰克香港有限公司）TGL-165医用冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）。1.3样品核酸提取使用Takara 9765核酸提取试剂盒，按照试剂盒说明书提取牛肉等14种肉类基因组DNA，利用NanoQ型分光光度计测定，并编号为1~14号样本，在-20 ℃冰箱中保存备用。1.4靶基因序列及LAMP反应引物的设计通过对牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉4种肉类基因序列进行生物信息学分析，确定16SrRNA为靶序列，并对靶序列在美国NCBI数据库进行blast，其特异性较好。采用郑丽兰等[14]的方法，根据LAMP引物设计软件进行LAMP引物设计，设计引物如下：牛肉三套引物；羊肉、猪肉、鸡肉各五套引物。引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。1.5LAMP体系的建立LAMP反应体系建立参照荣蓉等[15]方法，25 μL反应混合液为：12.5 μL扩增液、1 μL Bst DNA 聚合酶、2.6 μL引物混合液、2 μL引物模板、6.9 μL双蒸水。置于65 ℃恒温反应60 min。1.6LAMP优化试验1.6.1引物筛选试验根据预试验，设定温度65 ℃，时间60 min，以牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉4种肉类DNA为对象，进行最佳引物筛选试验，根据LAMP发生扩增反应的起峰时间确定最佳引物序列。1.6.2特异性试验在1.5所建立的LAMP体系中，利用LAMP反应管进行特异性试验，按照图1进行标号。其中15号为阴性对照，16号为阳性对照。第1组试验：1~14号加入LAMP扩增试剂和牛特异性引物，将14种肉类DNA样本按照牛、羊、猪、鸡、鸭、马、狐狸、鼠、兔、狗、驴、鸽子、鹅、貂编号顺序，分别加入1~14号反应管中，采用浊度法在650 nm处进行LAMP特异性检测。第2~4组试验，1~14号管加入LAMP扩增试剂不变，将特异性引物分别换成羊、猪、鸡的引物，将14种肉类DNA按照样本编号顺序加入1~14号管中，重复上述试验过程，进行LAMP特异性检测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.F001图1LAMP反应管1.7芯片优化试验将牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉4种肉类核酸样本编号，按照以下方式组合：空白（不加核酸）、样本1、样本3、样本12混合、样本34混合、样本123混合、样本234混合、样本1234混合，共8组组合方式。使用恒温扩增微流控芯片核酸分析仪进行芯片特异性验证试验。1.8芯片的应用从饲料市场购买16份饲料样本（每种饲料4份），核酸提取后用于芯片检测。检测出动物源性成分后，采用中华人民共和国农业行业标准NY/T 1946—2010[16]进行验证。2结果与分析2.1核酸提取试验结果14种肉基因组DNA提取后，样本的标号及浓度见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.T001表1样本的编号及浓度项目牛羊猪鸡鸭马狐狸鼠兔狗驴鸽子鹅貂样本编号1234567891011121314浓度/(g/mL)85.475.8103.4328.5268.3123.489.577.092.6150.9154.699.167.993.72.2LAMP优化试验结果2.2.1引物筛选结果（见表2）由表2可知，牛最佳引物N3，羊最佳引物Y4，猪最佳引物Z3，鸡最佳引物J4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.T002表2引物筛选结果引物名称引物序列(5'-3')引物名称引物序列(5'-3')N3牛F3TGCATAATGGTTTAACCAGAAZ3猪F3TGCATAATGGTTTAACCAGAAB3GGGGTATTTTTAAGGTTGAACTB3GGGGTATTTTTAAGGTTGAACTFIPGGTTCTTTTAAACTGCTCATGGGTA-ATCTAACAAAGAGAACTTTAGCTFIPGGTTCTTTTAAACTGCTCATGGGTA-ATCTAACAAAGAGAACTTTAGCTBIPTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGACT-TTTCTCGGACAACCAGCTBIPTATGTGGCAAAATAGTGAGAAGACT-TTTCTCGGACAACCAGCTLFCGTCTGGTTTCGGGGTATCTLFCGTCTGGTTTCGGGGTATCTLBTGTAGGTAGAGGTGAAAAGCCTLBTGTAGGTAGAGGTGAAAAGCCTY4羊F3GAGCTACTTGCGAGCAGCJ4鸡F3GAGCTACTTGCGAGCAGCB3TGTACCCCCATCGAATTGCB3TGTACCCCCATCGAATTGCFIPGCTCGGTAGGCTTTTCACCTCT-AAATTTGAGCGAACCCGTCTFIPGCTCGGTAGGCTTTTCACCTCT-AAATTTGAGCGAACCCGTCTBIPGTTCCCCCTTAACCCACCCC-AACCCCAACGTTCTCAAGGBIPGTTCCCCCTTAACCCACCCC-AACCCCAACGTTCTCAAGGLFTCATCCCACTCTTTTGCAACAGLFTCATCCCACTCTTTTGCAACAGLBCTAAAGACACCCACCTTTGTCAALBCTAAAGACACCCACCTTTGTCAA注：F3正向外引物、B3反向外引物、FIP正向内引物、BIP反向内引物、LF正向环引物、LB反向环引物。2.2.2特异性试验结果（见图2~图5）由图2可知，只有加入牛肉核酸的1号管中才发生扩增反应（16号管为阳性反应）.10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.F002图2牛引物特异性试验结果由图2~图5可知，在羊、猪、鸡特异性引物的作用下，只有羊肉、猪肉、鸡肉的核酸发生了扩增反应。即每种肉类的核酸，只有在与之对应的引物作用下，才能发生扩增反应，体现了引物良好的特异性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.F003图3羊引物特异性试验结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.F004图4猪引物特异性试验结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.F005图5鸡引物特异性试验结果2.3芯片特异性验证试验结果（见表3）由表3可知，无论是单一肉类品种的DNA，还是几种肉类混合的DNA，微流控芯片都能准确无误的检测到相应的肉源性基因的存在，体现出良好的特异性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.T003表3芯片特异性验证试验结果项目孔号检测结果(按样本编号)空 白1312341232341234空白对照1--------阴性对照2--------牛3-+-+-+-+羊4---+-+++猪5--+-++++鸡6----+-++阳性对照7++++++++空白对照8--------注：“+”表示阳性结果、“-”表示阴性结果。2.4芯片应用试验结果（见表4）由表4可知，牛、羊饲料中动物源性成分相对较少，而猪、鸡饲料中动物源性成分较多。1号、5号饲料含有猪、鸡源性成分，4号饲料中含有牛、羊源性成分，7号饲料含有牛、羊、猪源性成分。根据农业农村部在《饲料及饲料添加剂管理条例》中明确规定，禁止在反刍动物饲料中添加乳和乳制品以外的动物源性饲料产品。市场购买的牛、羊饲料合格率50%；10号猪饲料和13号鸡饲料中没有检测出肉源性成分，其他饲料都检测出不同动物源性成分，合格率仅25%。检测出来的其他肉源性成分，采用中华人民共和国农业行业标准NY/T 1946—2010进行验证，符合率100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.021.T004表4芯片应用检测结果动物源牛饲料羊饲料猪饲料鸡饲料12345678910111213141516牛源---+--+----+---+羊源---+--+------+--猪源+---+-+-+-++-+-+鸡源+---+---+-++-+++注：“+”表示阳性结果、“-”表示阴性结果。3讨论在LAMP特异性试验中不包括可能添加在饲料中的其他肉类以及鱼、虾等种类，特异性严谨度不足。试验中主要检出成分，如牛肉、羊肉、猪肉、鸡肉的多份样本，虽然来源不同，但品种单一。只有品种丰富才能更好地做到引物序列的种内保守、种间特异。LAMP反应优化管中试验是在25 μL环境下进行，而芯片反应池只有1.4 μL。因此，LAMP反应体系所确定的参数，需要芯片在实际检验中进一步优化。4结论试验以LAMP技术为基础，结合微流控芯片技术，开发饲料中动物源性成分检测的蝶式微流控芯片。该芯片分为3个区域，每个区域8个反应池，一次可检测3个样品。核酸的扩增和检测在50 min内完成，检测速度快、通量高。在LAMP试验中，进行最佳引物序列筛选和特异性试验，试验结果显示出引物特异性强的特点。芯片的特异性验证试验中，多种组合方式的归一化荧光曲线结果准确，显示了芯片良好的特异性。对市场饲料检测的芯片应用试验中，检测结果准确无误，验证的准确率100%，可以作为饲料中动物源性成分检测的依据。