紫花苜蓿是奶牛的优质饲草，但受雨季影响，苜蓿干草调制受到制约[1]，因此可以对紫花苜蓿进行青贮保存。但苜蓿中水溶性碳水化合物不足，缓冲能力高，附生乳酸菌数量少，青贮苜蓿的条件并不理想[2]。在青贮饲料中添加微生物可保证青贮饲料的优良品质。许多研究使用布氏乳杆菌和一些有机酸提高青贮品质，枯草芽孢杆菌也被用作微生物青贮饲料添加剂，以抑制好氧腐败并增加青贮饲料的体外消化[3]。枯草芽孢杆菌可产生纤维素酶，这些酶可通过水解植物细胞壁增加可溶性糖的释放，从而提高乳酸生产速率[4]。枯草芽孢杆菌产生的多肽和抗真菌化合物可以抑制酵母和丝状真菌等不良微生物生长，防止青贮饲料变质和真菌毒素产生[5]。因此，枯草芽孢杆菌被认为是一种有效的青贮饲料添加剂。Gandra等[6]研究表明，添加枯草芽孢杆菌能够显著增加青贮甘蔗中乙酸的含量，同时降低丁酸含量。李立波等[7]研究发现，枯草芽孢杆菌可显著降低玉米秸秆中木质纤维素，提高蛋白质含量，从而改善玉米秸秆的营养品质。在青贮过程中，添加酶制剂也有利于发酵，酶可将植物细胞壁的结构性多糖降解为单糖，为乳酸菌提供发酵底物，加速发酵，达到抑制梭酸菌发酵的目的。复合酶制剂含有多种酶，对青贮可能有一定的促进效用。本试验拟在苜蓿青贮中添加不同浓度的枯草芽孢杆菌和复合酶制剂，对其发酵品质和营养品质进行测定分析，旨在筛选出适合苜蓿青贮的添加量，提高青贮品质，为畜牧生产中苜蓿青贮技术的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料紫花苜蓿：中苜2号，现蕾期，第一茬，晾晒至水分含量55%，留茬高度7~8 cm，铡短长度为2~3 cm。紫花苜蓿营养成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.022.T001表1紫花苜蓿营养成分（风干基础）项目粗蛋白粗脂肪中性洗涤纤维酸性洗涤纤维粗灰分水溶性碳水化合物含量21.592.6443.1430.7711.197.94%复合酶制剂含有复合酶、GE生物制剂、植物甾醇、天然植物提取物、微生态制剂、有机微量元素等由河北草酶生物科技有限公司与武汉亚维微生物科技有限公司提供。枯草芽孢杆菌的有效活菌数≥10.0亿/g，购自河南土好金生物科技有限公司。1.2试验设计采用4×3双因素设计，每个处理3个重复。A0组不添加枯草芽孢杆菌，A1组添加0.1%枯草芽孢杆菌，A2组添加0.2%枯草芽孢杆菌，A3组添加0.3%枯草芽孢杆菌，B0组不添加复合酶制剂，B1组添加0.1%复合酶制剂，B2组添加0.2%复合酶制剂（均以鲜重为基础）。本试验采用200 mm×300 mm聚乙烯袋真空青贮，每袋装青贮原料1.5 kg，且将不同的添加剂均匀喷洒于青贮原料中，于室内常温青贮45 d。1.3试验方法袋开袋后，将青贮饲料均匀混合，称取20 g青贮样和180 mL蒸馏水一起放入榨汁机，榨汁1 min左右后过滤汁液，使用4层纱布过滤，将所得滤液用定性滤纸过滤至干净的烧杯中。将滤液分装为两部分，一部分滤液为备用样，放入-20 ℃冰箱中保存，另一部分滤液用于测定发酵指标pH值及氨态氮（NH3-N）、乳酸（LA）、乙酸（AA）含量。采用pH测定仪测定pH值，比色法测氨态氮（NH3-N）含量，气相色谱测定LA和挥发性脂肪酸（VFA）。将剩余青贮样品收集，烘干后粉碎过10目和40目筛，用于测定青贮营养品质。参照《饲料分析及饲料质量检测技术》[8]，测定青贮中DM、CP、EE、Ash、NDF、ADF、WSC含量。1.4感官评定采用德国农业协会（DLG）的饲料评价方法从青贮饲料的气味、结构、色泽等方面进行感官评定，共分为4个等级：1级（20~16分）、2级（15~10分）、3级（9~5分）、4级（4~0分）[9]。1.5隶属函数评价方法采用隶属函数评价法对不同处理青贮苜蓿的各指标进行评价，得出最佳处理。UX(+)=(X-Xmin)/(Xmax-Xmin)(1)UX(－)=1-UX(+) (2)式中：UX(+)为各指标呈正相关隶属函数值；UX(－)为各指标呈负相关隶属函数值；Ｘ为某样品某指标平均测定值；Xmax为某样品某指标最大测定值；Xmin为某样品某指标最小测定值[10]。1.6数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步处理，SPSS 23.0软件进行方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮感官评定的影响（见表2）由表2可知，A2+B2组青贮的得分最高，A0+B0组得分最低。12个处理组中，A0+B1组、A1+B1组、A1+B2组、A2+B2组、A3+B2组得分均在16~20之间，评定为等级1，其气味芳香，无丁酸臭味；其余处理组评定为等级2，芳香味弱，有较强的酸味。A0+B0组、A0+B2组和A1+B0组的叶子结构保存较差，其他处理组茎叶结构保持良好。各处理组的色泽均稍有变色，呈褐色。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.022.T002表2枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮感官评定的影响组别气味结构色泽总分等级A0+B0组831122A0+B1组1241171A0+B2组1131152A1+B0组931132A1+B1组1241171A1+B2组1241171A2+B0组941142A2+B1组1041152A2+B2组1341181A3+B0组1041152A3+B1组941142A3+B2组11411612.2枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮营养品质的影响（见表3）由表3可知，枯草芽孢杆菌与复合酶制剂处理对苜蓿青贮CP和EE含量具有显著的交互影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.022.T003表3枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮营养品质的影响（风干基础）项目DMAshCPEENDFADFWSCB0A041.14±0.34b13.47±0.1120.39±0.13a1.80±0.0841.11±0.37b32.03±0.30cb1.88±0.09aA141.74±0.51b13.17±0.1320.11±0.22b1.68±0.0941.34±0.40b31.24±0.16c1.60±0.17abA241.86±0.36b13.21±0.0719.88±0.04b1.66±0.1143.29±0.10a32.98±0.20ab1.41±0.03bA343.34±0.14a13.20±0.1020.65±0.05a1.94±0.1443.72±0.96a33.58±0.71a1.35±0.08bB1A040.98±0.25b13.37±0.1420.97±0.03a1.99±0.07a42.07±0.87ab32.25±0.78ab1.71±0.03aA141.24±0.38b13.46±0.1520.71±0.14ab1.74±0.07b39.87±0.84b30.39±0.51b1.42±0.06bA242.78±0.10a13.31±0.1421.07±0.18a1.83±0.08ab42.73±0.59a32.90±0.40a1.40±0.02bA343.13±0.08a13.23±0.1320.31±0.05b2.04±0.07a44.36±0.80a33.56±0.84a1.31±0.03bB2A040.96±0.26b13.66±0.1221.11±0.15ab1.99±0.12ab44.19±0.6433.68±0.50a1.83±0.05aA140.98±0.40b13.51±0.1020.25±0.25c1.77±0.10b42.52±0.5531.53±0.42b1.54±0.10abA242.53±0.60a13.48±0.1521.37±0.12a1.77±0.09b43.05±0.3633.24±0.29a1.44±0.12bA342.78±0.36a13.45±0.1120.42±0.18bc2.18±0.10a43.33±0.3233.93±0.37a1.36±0.04bP值复合酶制剂0.310.010.010.050.030.070.21枯草芽孢杆菌0.010.200.020.060.010.010.01复合酶制剂×枯草芽孢杆菌0.340.850.010.020.060.740.38注：相同复合酶制剂水平下，同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。%添加复合酶制剂对苜蓿青贮Ash、CP、EE和NDF含量具有显著影响（P0.05）。与B0组相比，添加复合酶制剂显著增加了Ash和CP的含量（P0.05）。添加枯草芽孢杆菌对苜蓿青贮DM、CP、NDF、ADF和WSC含量具有显著影响（P0.05）。添加不同剂量的复合酶制剂时，A3组DM含量均显著高于A0、A1组（P0.05）。在B2水平上，A2组的CP含量显著高于A1和A3组（P0.05），A1组ADF含量显著低于其他各组（P0.05）。各复合酶制剂添加水平下，苜蓿青贮WSC含量均随着枯草芽孢杆菌添加量增加而显著降低（P0.05）。2.3枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮发酵品质的影响（见表4）由表4可知，枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮的pH值具有显著交互作用（P0.05）。添加复合酶制剂和枯草芽孢杆菌对苜蓿青贮的pH值、NH3-N均具有显著影响（P0.05），添加复合酶制剂对苜蓿青贮的AA含量具有显著影响（P0.05），而添加枯草芽孢杆菌对LA含量具有显著影响（P0.05）。在不同复合酶制剂添加水平下，A3组NH3-N的含量显著高于A0和A1组（P0.05），且NH3-N含量随着枯草芽孢杆菌添加量的增加呈显著上升趋势（P0.05）。在B1水平下，A3组的LA含量显著高于A2组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.022.T004表4枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮发酵品质的影响（风干基础）项目pH值NH3-N/(mg/g)AA/%LA/%B0A04.73±0.030.24±0.01b0.44±0.015.67±0.12aA14.73±0.030.35±0.06b0.46±0.025.03±0.09bA24.83±0.030.35±0.04b0.42±0.015.05±0.04bA34.83±0.030.62±0.06a0.45±0.005.11±0.06ab续表4　枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮发酵品质的影响（风干基础）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.022.T005项目pH值NH3-N/(mg/g)AA/%LA/%B1A04.60±0.00b0.32±0.04b0.32±0.005.23±0.12aA14.67±0.03b0.27±0.02b0.31±0.015.04±0.03bA24.87±0.03a0.39±0.03b0.32±0.005.04±0.06bA34.83±0.03a0.55±0.06a0.31±05.25±0.09aB2A04.70±0.00b0.29±0.04c0.31±0.005.30±0.13A14.87±0.03a0.43±0.00b0.31±0.015.19±0.14A24.77±0.03ab0.50±0.05ab0.33±0.015.06±0.06A34.87±0.03a0.60±0.06a0.32±0.015.01±0.02P值复合酶制剂0.030.040.010.31枯草芽孢杆菌0.010.010.970.01复合酶制剂×枯草芽孢杆菌0.010.380.120.342.4隶属函数分析及综合价值排序（见表5）由表5可知，DM、CP、EE、WSC、LA、AA为正向指标，Ash、pH值、NH3-N、NDF、ADF为负向指标。对各处理组指标的函数值平均并排序，平均值越大，排序越靠前，表示其综合价值最高。各处理组的排序为A2+B2组A1+B2组A3+B2组A1+B1组A0+B1组A3+B0组A2+B1组A0+B2组A2+B0组A1+B0组A3+B1组A0+B0组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.022.T006表5隶属函数分析及综合价值排序组别DMAshCPEENDFADFWSCNH3-NpH值AALA隶属函数值营养价值排序A0+B0组0.350.490.330.490.470.470.560.370.330.520.390.4312A0+B1组0.560.480.500.530.490.520.500.450.500.540.540.515A0+B2组0.490.480.460.310.720.610.400.500.500.500.380.498A1+B0组0.560.360.570.530.380.440.620.380.330.500.380.4610A1+B1组0.540.500.690.450.470.510.470.430.670.560.430.524A1+B2组0.640.470.500.610.540.510.600.610.670.350.380.532A2+B0组0.490.480.590.440.450.510.530.420.330.630.350.479A2+B1组0.430.640.590.540.460.410.420.540.670.400.350.507A2+B2组0.560.500.340.240.680.560.560.560.670.650.570.541A3+B0组0.640.430.460.580.580.470.380.620.330.600.450.506A3+B1组0.500.560.400.410.440.420.350.510.330.500.450.4411A3+B2组0.420.490.670.500.470.530.410.620.670.430.560.5233讨论3.1枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮感官评定的影响青贮饲料的青贮品质不同，其气味、色泽、质地、结构等外形特征也存在差异，气味芳香、色泽与青贮原料相近、茎叶结构完整的青贮饲料，适口性更好。本研究中，各处理组苜蓿青贮在色泽和结构上差异不大，添加0.2%枯草芽孢杆菌与0.2%复合酶制剂的青贮苜蓿感官评价均优于其他处理组，无霉变，具有芳香味，色泽呈褐色，结构良好，属于优质饲料。对照组芳香味弱，具有较强的酸味，叶片保存不良，属于2级青贮饲料。3.2枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮营养品质的影响DM和CP含量是评价青贮饲料营养成分的重要指标[11]。本研究结果表明，苜蓿青贮的DM含量随着枯草芽孢杆菌添加量的增加而升高。Yang等[12]指出，枯草芽孢杆菌大量繁殖可产生多种次级代谢产物和菌体蛋白，这可能是DM含量增加的原因。本研究中，添加复合酶制剂组CP含量有一定的提升，且CP含量随着复合酶制剂添加量的增加呈上升趋势，可能是由于复合酶制剂中的多种酶及营养物质为乳酸菌提供了发酵底物，且补充了少量蛋白，其中添加0.2%复合酶制剂处理组的效果最好。本试验中，枯草芽孢杆菌添加量为0.2%的处理组CP含量高于添加量为0.1%和0.3%的处理组，可能是由于枯草芽孢杆菌添加量为0.2%时，青贮饲料中的营养物质能够满足枯草芽孢杆菌的快速繁殖，且枯草芽孢杆菌产蛋白酶能力强，还能够分泌多种酶系，各种酶相互协同作用生成一定量的CP[13]，提高青贮饲料中CP含量，与张艳萍等[14]研究结果相似。NDF和ADF是反映饲料饲用价值的重要指标，DNF和ADF含量越低，动物对其消化率越高，饲用价值越大[15]。本研究中，添加0.1%枯草芽孢杆菌组的NDF和ADF含量虽有降低，但与未添加组相比差异不显著，与万荣等[16]研究结果相似，表明复合酶制剂对NDF、ADF无降解作用。3.3枯草芽孢杆菌和复合酶制剂对苜蓿青贮发酵品质的影响青贮主要通过乳酸菌厌氧发酵产生LA及少量AA，使pH值短时间内快速降低，抑制其他微生物的繁殖与代谢，从而达到青贮效果，降低饲料的营养损失，延长保质期限[17]。因此，发酵品质直接反映了青贮品质，而发酵品质中乳酸含量、pH值及丙酸含量是决定发酵品质的关键指标。邹诗雨等[18]研究表明，乳酸含量越高，丙酸含量和pH值越低，能够有效抑制发酵过程中有害微生物的繁殖，保障青贮发酵成功。pH值是评定青贮发酵品质的关键指标[19]，pH值低有助于乳酸菌的快速发酵，从而抑制有害菌生长，减缓蛋白质降解，减少丙酸（PA）、丁酸（BA）等物质生成[20]。优质青贮饲料pH值在4.2~4.8之间为良好，4.8以上则认为发酵品质较差[21]。本研究中，添加0.1%复合酶制剂或同时添加0.1%复合酶制剂和0.1%枯草芽孢杆菌的处理组pH值较理想。NH3-N含量能够反映青贮过程中蛋白质的降解情况，蛋白质降解越严重，NH3-N含量越高，不利于优质青贮饲料形成[22]。青贮饲料发酵过程会产生LA、AA、PA和BA，LA占比越大，BA占比越小，青贮效果越好[23]，Lara等[24]研究发现，添加枯草芽孢杆菌会降低玉米青贮中的LA含量，与本研究结果相似。3.4隶属函数分析及综合价值排序由于枯草芽孢杆菌与复合酶制剂存在交互作用，各处理不同指标的趋势不同，以任意单一的指标评定最优组合较为片面。因此，为合理、全面地评定其营养价值，将各处理组的11个指标进行隶属函数分析，求得平均值，值越大代表其青贮效果越好。本试验通过对隶属函数的分析得出，0.2%枯草芽孢杆菌+0.2%复合酶制剂组的平均值最大，表明同时添加0.2%枯草芽孢杆菌和0.2%复合酶制剂青贮效果最好。4结论本研究表明，添加枯草芽孢杆菌和复合酶制剂均在不同程度上改善了苜蓿青贮品质，降低了营养物质损失。枯草芽孢杆菌与复合酶制剂对CP、EE、pH值存在交互作用。同时添加0.2%枯草芽孢杆菌和0.2%复合酶制剂对紫花苜蓿青贮效果较好。