斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）俗称青斑，属鲈形目、鮨科、石斑鱼属，是我国福建、广东和海南等地重要的海水养殖鱼类[1-2]。随着养殖规模的不断扩大，养殖水体环境逐步恶化，因溶藻弧菌[3]、河流弧菌[4]和变形假单胞菌[5]感染引发的疾病频繁发生，给石斑鱼养殖业带来损失[4]。在治疗细菌性疾病过程中，滥用抗生素导致了耐药性病原菌和药物残留，严重制约了水产养殖业的可持续发展[6]，因此寻求高效、绿色、安全的饲料添加剂具有重要意义。本课题组前期从石斑鱼肠道筛选到一株益生菌——短小芽孢杆菌SE5，饵料中添加SE5（1.0×108 CFU/g）能够有效提高斜带石斑鱼饲料效率，改善免疫功能，调节肠道菌群平衡[7-8]。益生菌和益生元组合成的饲料添加剂为合生素，其功效往往优于单独添加益生元或益生菌[9-10]。丁酸是在肠道中存在的一种短链脂肪酸，可为肠上皮细胞生长发育直接供能，但丁酸半衰期很短，极易挥发，不适合在饲料中直接添加[11]。三丁酸甘油酯半衰期长，安全无毒副作用，被肠道胰脂肪酶水解后产生3个分子的丁酸，是动物良好的丁酸来源。本课题组前期研究发现，不同梯度果寡糖（FOS）能够提高斜带石斑鱼的生长性能、免疫力和肠道健康[12-13]。本研究在此基础上，探究不同梯度果寡糖添加短小芽孢杆菌（SE5）和三丁酸甘油酯（Tb）对斜带石斑鱼生长、免疫和肠道形态的影响，为复合添加剂的开发利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料斜带石斑鱼幼鱼购自厦门小嶝岛某石斑鱼育苗场。FOS和Tb由江苏易实生物科技有限公司提供。本试验以鱼粉和豆粕为蛋白源，鱼油和豆油为脂肪源，配制4组等氮、等脂饵料。基础饵料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.T001表1基础饵料组成及营养水平（风干基础）原料组成含量营养水平合计100.00秘鲁鱼粉42.00干物质94.82豆粕27.00粗蛋白48.08虾粉3.00粗脂肪10.13面粉19.90粗灰分10.06鱼油2.00豆油2.00卵磷脂2.00多维0.30多矿0.50氯化胆碱0.30磷酸二氢钙1.00注：1.多维和多矿购自厦门百穗行科技股份有限公司。2.营养水平均为实测值。%1.2试验设计与饲养管理正式试验前进行10 d的驯养，驯养期间从商品饵料过渡至基础饵料，每天饱食投喂2次（8：30、17：30）。驯养结束后选取300尾平均体重为（18.13±0.02） g的健康石斑鱼，随机分为4组，每组3个重复，每个重复25尾鱼，置于75 cm×45 cm×50 cm的玻璃水族缸进行56 d养殖试验。T1组（对照组）斜带石斑鱼饲喂基础饵料，T2组、T3组、T4组在T1组的基础上分别添加0.05% FOS+SE5+0.10% Tb、0.10% FOS+SE5+0.10% Tb和0.20% FOS+SE5+0.10% Tb。将原料粉碎，过60目筛，按照配方比例采用逐级扩大法混匀。短小芽孢杆菌SE5添加量均为1×108 CFU/g，均匀喷洒在已混匀的饵料原料中，使用双螺杆制粒机制成直径为2.5 mm的软颗粒饵料，在室温下风干12 h，分装于自封袋，置于4 ℃保存。养殖用水为一级砂滤海水，试验期间水温保持在25~29 ℃，pH值约为8，盐度为24‰~30‰，连续24 h充气，每日换水量为养殖水体的50%。1.3样品采集分别于试验第28、56 d对每个缸的鱼计数，称总重，统计各组鱼的生长性能、饵料利用率和存活率。于试验第28、56 d分别从每个缸中随机捞取4尾鱼，用40 mg/L丁香酚麻醉，血样取自尾静脉，于1.5 mL离心管保存，在4 ℃恒温24 h离心（10 000 r/min、10 min）后收集血清。采集血液后，取出肠道，其中两尾鱼的肠道于-80 ℃冰箱保存，用于测定消化酶活性；另外2尾鱼的前肠（2 cm左右）置于Bouin氏液中固定超过12 h，用于制作肠道切片。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能根据公式计算增重率（WGR）、特定生长率（SGR）、饵料系数（FCR）和存活率（SR）。WGR=(Wf -W0)/W0×100%(1)SGR=(lnWf -lnW0)/T×100%(2)FCR=FI/(Wf -W0)(3)SR=(N0-Nf)/N0×100%(4)式中：W0为鱼的初重（g）；Wf为鱼末重（g）；FI为每尾鱼饵料摄入总量（g）；T为饲养天数（d）；N0为初始鱼尾数；Nf为最终鱼尾数。1.4.2血清免疫指标采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定血清超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）、酸性磷酸酶（ACP）和碱性磷酸酶（AKP）的活性。1.4.3肠道消化酶活性肠道样品测定前经4 ℃冰箱解冻，使用滤纸吸干表面水分，剪取肠道组织约0.1 g，加入9倍体积的灭菌生理盐水匀浆，4 ℃、3 000 r/min离心10 min，取上清液保存。采用福林酚法测定蛋白酶活性，采用分光光度计法测定淀粉酶（AMY）和脂肪酶（LPS）活性。1.4.4肠道形态观察固定在Bouin氏液中的前肠经一系列乙醇溶液脱水，使用二甲苯清除并嵌入石蜡中，切割为5 μm的切片，进行HE染色，使用Image-Pro Plus 6.0软件测量前肠绒毛高度、绒毛宽度、绒毛数量和肌层厚度。1.5数据统计与分析采用SPSS 22.0软件中的单因素方差分析和Duncan's多重比较法检验各组间差异，结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合添加剂对斜带石斑鱼长性能的影响（见表2）由表2可知，不同日粮饲喂的斜带石斑鱼饵料系数差异不显著（P0.05）。试验28 d，与T1组相比，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼末重、增重率、特定生长率均有提高，其中T3组增幅最大（P0.05）。试验56 d，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼末重、增重率、特定生长率均显著高于T1组（P0.05），各组存活率均接近100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.T002表2复合添加剂对斜带石斑鱼生长性能的影响项目初重/(g/尾)末重/(g/尾)增重率/%特定生长率/(%/d)饵料系数存活率/%28 dT1组（对照组）18.10±0.0134.31±1.7289.63±9.562.28±0.181.33±0.09—T2组18.09±0.0135.04±0.3193.59±1.822.36±0.031.38±0.04—T3组18.12±0.0137.88±2.00105.46±7.322.56±0.131.35±0.11—T4组18.12±0.0435.83±0.6597.733±3.932.43±0.071.29±0.03—56 dT1组（对照组）18.10±0.0161.83±1.73b241.80±9.65b2.19±0.05b1.32±0.1198.67±1.33T2组18.09±0.0170.64±3.00a290.47±16.51a2.43±0.07a1.24±0.02100.00±0.00T3组18.12±0.0173.16±3.14a303.83±17.27a2.49±0.08a1.18±0.03100.00±0.00T4组18.12±0.0477.90±0.98a329.71±6.20a2.57±0.05a1.15±0.05100.00±0.00注：1.同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），下表同。2.“—”为未统计。2.2复合添加剂对斜带石斑鱼肠道消化酶活性的影响（见表3）由表3可知，试验28 d，与T1组相比，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼肠道蛋白酶和脂肪酶活性显著升高（P0.05）；淀粉酶活性随复合添加剂中果寡糖含量增加呈上升趋势，与T1组相比，T4组斜带石斑鱼淀粉酶活性显著升高（P0.05）。试验第56 d，与T1组相比，T3组、T4组斜带石斑鱼蛋白酶和淀粉酶活性显著升高（P0.05），T4组斜带石斑鱼的脂肪酶活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.T003表3复合添加剂对斜带石斑鱼肠道消化酶活性的影响项目蛋白酶/(U/mg prot)淀粉酶/(U/mg prot)脂肪酶/(U/g prot)28 dT1组（对照组）265.72±21.33c0.77±0.08b11.84±0.77bT2组334.18±9.46b1.00±0.08ab15.36±1.23aT3组324.87±25.02b1.30±0.25ab16.99±0.44aT4组447.64±18.57a1.70±0.24a16.07±0.91a56 dT1组（对照组）277.64±19.88b0.93±0.02c17.45±1.16bT2组276.44±16.33b0.99±0.04c20.52±1.24abT3组376.32±17.80a1.54±0.05a19.63±1.32abT4组334.72±9.89a1.30±0.01b21.91±0.98a2.3复合添加剂对斜带石斑鱼免疫指标的影响（见表4）由表4可知，试验28 d时，与T1组相比，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼血清溶菌酶活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.T004表4复合添加剂对斜带石斑鱼免疫指标的影响项目超氧化物歧化酶/(U/mL)溶菌酶/(U/mL)酸性磷酸酶/(U/100 mL)碱性磷酸酶/(U/100 mL)28 dT1组（对照组）211.89±3.37b123.81±11.00b8.33±0.14b10.66±0.45T2组233.62±7.88b161.90±5.50a8.30±0.56b9.10±0.46T3组261.62±1.08a180.95±16.50a9.98±0.51a10.35±0.79T4组263.57±12.81a176.19±8.25a9.42±0.39ab10.74±0.4456 dT1组（对照组）222.04±9.96b106.67±12.027.72±0.07b8.88±0.23T2组258.36±2.18ab115.00±20.217.71±0.15b7.85±0.19T3组268.27±14.73a125.00±2.898.51±0.33a8.58±0.59T4组273.22±26.08a126.67±8.828.19±0.21ab9.14±0.49试验28、56 d时，与T1组相比，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼血清超氧化物歧化酶活性均有升高，其中T3组和T4组显著高于T1组（P0.05）；T3组斜带石斑鱼血清酸性磷酸酶活性最高，显著高于T1组（P0.05）。2.4复合添加剂对斜带石斑鱼肠道组织形态的影响（见图1~图3）由图1和图2可知，各组石斑鱼肠黏膜形态结构都较为完整，绒毛排列整齐，与T1组相比，T2组、T3组、T4组石斑鱼肠绒毛高度、绒毛宽度、肌层厚度和绒毛数量均有所增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.F001图1复合添加剂对28 d时斜带石斑鱼肠道形态的影响（100×）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.F002图2复合添加剂对56 d时斜带石斑鱼肠道形态的影响（100×）由图3（a）可知，与对照组相比，T2组、T3组、T4组石斑鱼肠绒毛高度显著增加（P0.05），T4组显著高于T2组和T3组（P0.05）。试验28 d时，T2组、T3组、T4组石斑鱼肠绒毛宽度和肌层厚度显著高于T1组（P0.05），T4组肠绒毛宽度显著高于T3组（P0.05）；T2组和T3组绒毛数量显著高于T1组（P0.05）。试验56 d时，T2组~T4组石斑鱼肠绒毛宽度和绒毛数量显著高于T1组（P0.05）；T2组和T4组肌层厚度显著高于T1组（P0.05）。图3复合添加剂对斜带石斑鱼肠道形态的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.F3a1（a）绒毛高度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.F3a2（b）绒毛宽度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.F3a3（c）肌层厚度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.013.F3a4（d）绒毛数量3讨论3.1复合添加剂对斜带石斑鱼生长性能的影响合生素由于结合了益生元和益生菌的积极作用，通常表现出更好的促生长作用[14]。研究表明，与单独添加益生菌或益生元相比，日粮中添加合生素可使锦鲤（Cyprinus carpio）[15]、奥尼罗非鱼（Oreochromis niloticus♀×O. aureus♂）[16]、卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）[17]、日本鳗鲡（Anguilla japonica）[18]表现出更高的WGR。此外，三丁酸Tb可维持菊黄东方鲀（Takifugu flavidus）肠道微生物平衡[19]，增强建鲤（Cyprinus carpiovar）肠道抗氧化能力[20]，从而促进鱼生长。本研究中，复合添加剂（FOS+SE5+Tb）饲养斜带石斑鱼56 d，显著提高了斜带石斑鱼WGR和SGR，与Rodriguez-Estrada等[21]发现在饵料中添加甘露寡糖+粪肠球菌+聚羟基丁酸在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）上的应用结果一致。肠道的消化和吸收能力对鱼类生长具有重要作用[22]。消化酶活性尤其是蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，与鱼类的消化能力密切相关。张春暖等[15]研究发现，锦鲤饵料中添加0.3% FOS和1×107 CFU/g德式乳酸菌可提高锦鲤肠道蛋白酶和脂肪酶活性。李富东[23]发现，将FOS和克劳氏芽孢杆菌联合添加到牙鲆（Paralichthys olivaceus）饵料中，牙鲆肠道蛋白酶和淀粉酶活性均有升高。Liu等[24]发现，凡纳滨对虾饵料中联合使用Tb和FOS，其效果优于单独添加Tb。金子博[25]研究发现，三丁酸甘油酯和凝结芽孢杆菌在提升虎龙杂交斑（E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatus♂）肠道脂肪酶活性上具有协同作用。本研究发现，试验28 d时，T2组、T3组、T4组斜带石斑鱼肠道蛋白酶和脂肪酶活性显著高于对照组，T4组肠道淀粉酶活性显著高于对照组，试验56 d，T3组和T4组肠道蛋白酶和淀粉酶活性显著高于对照组，表明复合添加剂（FOS+SE5+Tb）可提高斜带石斑鱼肠道消化酶活性，进而改善生长性能。3.2复合添加剂对斜带石斑鱼血清免疫功能的影响Tb可通过增强机体免疫物质的活性和提高抗氧化能力增强机体免疫力[26]。Cheng等[27]研究发现，在饵料中添加Tb可显著改善草鱼（Ctenopharyngodon idella）血清LZM和SOD活性。Liu等[24]在高豆粕日粮中补充Tb，发现可显著改善凡纳滨对虾血淋巴ACP和AKP活性。研究表明，FOS和芽孢杆菌均可以通过抑制病原微生物、增强免疫力及水生动物的疾病抵抗力[28-30]，并且FOS和芽孢杆菌具有协同作用，联合应用能够更好地提高三角鲂（Megalobrama terminalis）[30]、海参（Apostichopus japonicus）[31]和锦鲤[15]的免疫功能。本研究发现，斜带石斑鱼血清SOD、LZM活性显著升高，表明复合添加剂有效增强了机体的免疫功能。可能是因为FOS和Tb作为肠道微生态平衡的调节因子，能够促进肠道乳酸菌等有益菌的增殖[19,30]，而乳酸菌可以通过与病原菌竞争黏附位点增强宿主的免疫机能[32]。3.3复合添加剂对斜带石斑鱼肠道组织形态的影响肠道既是营养物质消化和吸收的主要场所，也是抵御外部环境各种刺激的重要屏障[33-34]。研究表明，在饵料中补充Tb能够修复黑鲷（Acanthopagrus schlegelii）[35]和黄姑鱼（Nibea albiflora）[36]高豆粕引起的肠道损伤，并维持肠道结构的完整性。与单独补充Tb相比，Tb和FOS联合使用可进一步改善凡纳滨对虾肠绒毛高度[24]，Tb和甘露寡糖（MOS）联合添加可有效提高菊黄东方鲀前肠和后肠绒毛高度和宽度[19]。肖世玖等[37]研究发现，团头鲂饵料中补充合生素（地衣芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌和低聚木糖）能够显著提高绒毛高度。本研究发现，饵料中补充复合添加剂（FOS+SE5+Tb）可显著提高斜带石斑鱼肠绒毛高度、绒毛宽度、绒毛数量和肌层厚度，以T4组效果较好。4结论复合添加剂（FOS+SE5+Tb）能够改善斜带石斑鱼的生长性能、免疫力以及肠道形态，且T4组（0.2% FOS+1.0×108 CFU/g SE5+0.1%Tb）效果较好。