姜黄为姜科植物姜黄（Curcuma longa L.）的干燥根茎，属于《饲料原料目录》中可饲用天然植物[1]。姜黄主要活性成分为姜黄素类化合物[2]，可用作天然着色剂、食品防腐剂[3-4]，具有抗炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤、解毒等功能[5-11]。姜黄及其提取物作为一种天然饲料添加剂已经被广泛添加至动物基础饲粮中，用于提高畜禽、水产动物的生长性能和免疫力[12-13]，改善体色[14]，具有广阔的开发前景和应用价值。目前，市面上姜黄作为饲用用途时缺少相关质量标准。为保障天然植物饲料原料的使用质量安全，有必要对天然植物饲料原料的质量安全进行科学风险预警监测。特征图谱是基于图谱中某些主要成分或有效成分的特征信息，用于控制和鉴别中药质量，与指纹图谱相比，具有专属性强、适用性广等优势[15-16]。研究基于HPLC特征图谱技术对姜黄粗提物建立质量控制示范方法，旨在能够更好地甄别单一型“饲用植物粗提物饲料原料”是否真实，确保可饲用天然植物饲料原料质量安全。1材料与方法1.1试验仪器Waters ARC高效液相色谱仪（美国Waters公司）；KQ5200DE 型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；移液枪（德国Eppendorf公司）；超纯水系统（ELGA）；TG16-WS离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；New Classic ME十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO）；无菌注射器(5 mL，圣光医用制品)；0.22 µm有机相针式滤器及样品瓶(八方世纪科技，北京)；色谱柱：Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 µm）。1.2试验材料无水乙醇（GENERAL-REAGENT）；乙腈（色谱纯，Merck）；超纯水（ELGA）；对照品姜黄素（110823-201706，≥98%）、去甲氧基姜黄素（112003-201501，≥98%）、双去甲氧基姜黄素（112004-201501，≥95%）及姜黄对照药材（121188-201605）均购自购于中国食品药品检定研究院。30批姜黄原料购自安国、亳州、廉桥、禹州四大药材市场，经湖南中医药大学杨广民教授鉴定，均为姜黄科植物姜黄（Curcuma longa L.）的干燥根茎。30批姜黄原料详细信息见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.020.T001表130批姜黄原料采购信息样品编号部位采购地点样品编号部位采购地点1JH-AG-YN-01根茎河北安国16JH-BZ-YN-02根茎安徽亳州2JH-AG-YN-02根茎河北安国17JH-BZ-YN-03根茎安徽亳州3JH-AG-YN-04根茎河北安国18JH-BZ-YN-04根茎安徽亳州4JH-AG-YN-06根茎河北安国19JH-BZ-YN-05根茎安徽亳州5JH-AG-YN-07根茎河北安国20JH-BZ-YN-06根茎安徽亳州6JH-AG-YN-08根茎河北安国21JH-BZ-SC-01根茎安徽亳州7JH-AG-YN-09根茎河北安国22JH-BZ-SC-02根茎安徽亳州8JH-AG-YN-10根茎河北安国23JH-BZ-SC-03根茎安徽亳州9JH-AG-YN-12根茎河北安国24JH-BZ-SC-04根茎安徽亳州10JH-AG-YN-13根茎河北安国25JH-BZ-SC-05根茎安徽亳州11JH-AG-SC-03根茎河北安国26JH-BZ-GX-01根茎安徽亳州12JH-AG-SC-05根茎河北安国27JH-BZ-GX-03根茎安徽亳州13JH-AG-SC-11根茎河北安国28JH-YZ-GX-01根茎河南禹州14JH-AG-SC-14根茎河北安国29JH-YZ-GX-02根茎河南禹州15JH-BZ-YN-01根茎安徽亳州30JH-HN-LQ-01根茎湖南廉桥1.3试验方法1.3.1色谱条件色谱柱为Sunfire C18（4.6 mm×250 mm，5 µm)。以0.1%甲酸溶液（A）和乙腈（B）为流动相，梯度洗脱：0~5 min、10%~15% B；5~25 min，15%~60% B；25~45 min，60%~70% B；45~55 min，70%~75% B，进样量10 μL、流速1 mL/min、柱温35 ℃、检测波长254 nm。1.3.2样品预处理将各批次姜黄样品晒干粉碎，过1号筛，取粉碎过筛后的姜黄样品100 g，采用70%乙醇回流提取2次（800、500 mL），每次1 h，合并提取液。过滤，滤液减压回收乙醇至稠膏状，低温干燥，研细，所得粉末即为姜黄粗提物。1.3.3溶液的制备1.3.3.1供试品溶液的制备精密称定姜黄粗提物0.20 g，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，称定重量，超声处理（功率250 W、频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，采用70%乙醇补足减失的重量，12 000 r/min 离心10 min，静置，取上清液采用0.22 μm滤膜过滤。1.3.3.2标准溶液的制备分别精密称定姜黄素、去甲氧基姜黄素、双去甲氧基姜黄素对照品适量，采用甲醇配制成浓度为0.2 g/L的储备液，于4 ℃下储存备用。1.3.4方法学考察1.3.4.1精密度试验取姜黄粗提物样品0.20 g，精密称定，按“1.3.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”项下色谱条件连续进样6次。以3号峰为参照峰（S），其他7个特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.1%、1%，说明该方法精密度良好。1.3.4.2重复性试验取姜黄粗提物样品0.20 g，精密称定，按照“1.3.3.1”项下方法平行制备6份样品，按照“1.3.1”项下色谱条件进样。以3号峰为参照峰（S），其他7个特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.1%、1.5%，说明该方法重复性满足要求。1.3.4.3稳定性试验取姜黄粗提物样品0.20 g，精密称定，按“1.3.3.1”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10、12、24 h按“1.3.1”项下色谱条件进样。以3号峰为参照峰（S），其他7个特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别小于0.5%、1.5%，说明该方法稳定。2结果与分析2.1特征图谱的建立将30批姜黄粗提物样品，按照“1.3.3.1”项下方法制备供试品溶液，按照“1.3.1”项下色谱条件测定，记录色谱图。采用仪器自带软件（Empower 3）将所有色谱图叠加（积分参数设定为：阈值：25、最小峰面积：5 000、最小峰宽：30），根据叠加图谱中色谱峰分布，选择各批次明显共有色谱峰作为特征峰。再将色谱数据转化为*.AIA格式，将格式转化后的文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012年版）进行二次验证，共有特征峰在30批样品中均能够被识别，建立姜黄粗提物特征图谱的对照图谱（R）。30批姜黄粗提物的HPLC特征图谱见图1。通过两种方式，最终确定8个共有特征峰，按出峰时间依次标记为1~8号峰，以色谱峰3（姜黄素）为参照峰，计算其他7个色谱峰的相对保留时间。以上指认特征峰均为姜黄中有效成分，因此我们认为建立的特征图谱具有代表性，能够表征待测所含成分的专属性，能对姜黄粗提物进行质量评价。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.020.F001图130批姜黄粗提物的HPLC特征图谱2.2参照峰的指认通过标准品比对，指认1号峰（RT 27.66 min）为双去甲氧基姜黄素，2号峰（RT 28.15 min）为去甲氧基姜黄素，3号峰（RT 28.65 min）为姜黄素。由于姜黄素为姜黄的主要有效成分、保留时间适中、峰强度较高，符合参照峰的要求。因此，设定其为参照物（S峰）。30批姜黄粗提物特征图谱中8个特征峰的相对保留时间见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.020.T002表230批姜黄粗提物特征图谱中8个特征峰的相对保留时间样品编号1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰7号峰8号峰RSD/%0.1190.01100.1300.1440.1640.4930.205AG-YN-010.9650.9821.0001.3661.4731.7171.7361.892AG-YN-020.9590.9821.0001.3661.4721.7161.7361.892AG-YN-040.9650.9821.0001.3661.4731.7171.7361.874AG-YN-060.9650.9821.0001.3661.4731.7171.7361.892AG-YN-070.9650.9831.0001.3661.4731.7171.6881.893AG-YN-080.9650.9821.0001.3661.4731.7171.7361.892AG-YN-090.9650.9821.0001.3661.4731.7171.7361.892AG-YN-100.9650.9821.0001.3661.4731.7171.7371.893AG-YN-120.9660.9821.0001.3641.4701.7131.7331.888AG-YN-130.9650.9821.0001.3651.4711.7141.7341.889AG-SC-030.9650.9831.0001.3651.4711.7141.7331.889AG-SC-050.9650.9831.0001.3641.4711.7141.7341.889AG-SC-110.9650.9831.0001.3651.4711.7141.7341.890AG-SC-140.9660.9831.0001.3651.4711.7141.7341.890BZ-YN-010.9660.9821.0001.3621.4681.7111.7301.886BZ-YN-020.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885BZ-YN-030.9660.9831.0001.3621.4681.7101.7301.886BZ-YN-040.9660.9821.0001.3621.4681.7111.7301.886BZ-YN-050.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885BZ-YN-060.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885BZ-SC-010.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885BZ-SC-020.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885BZ-SC-030.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885BZ-SC-040.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885BZ-SC-050.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.886BZ-GX-010.9660.9821.0001.3621.4681.7111.7301.885BZ-GX-020.9660.9821.0001.3621.4681.7111.7301.886YZ-GX-010.9660.9821.0001.3621.4671.7101.7291.885YZ-GX-020.9660.9821.0001.3621.4681.7101.7301.885LQ-010.9660.9831.0001.3621.4681.7101.7301.885由表2可知，各批次姜黄粗提物样品中其他7个特征峰的相对保留时间RSD均在0.5%以下。3讨论姜黄富含挥发油成分，因此不适合使用纯水作为提取溶剂。试验选用常规70%乙醇溶液回流制备姜黄粗提物，对不同回流时间（1、2 h）进行考察。根据色谱结果显示，不同回流时间下色谱峰响应无明显差别，为简化操作，提高效率，选用70%乙醇溶液回流2次，每次1 h。同时，对色谱柱、洗脱梯度、柱温、进样量等色谱条件进行一系列优化，旨在获得色谱峰的最佳分离度、峰形和色谱响应，最终色谱条件见“1.3.1”。此外，随机挑选5批姜黄原料，参照“1.3.3.1”方法制备，“1.3.1”仪器条件测定。结果表明，姜黄粗提物与原料中的8个特征峰完全一致，证明粗提物制备方法可行，对特征峰的选取合理。试验收集的姜黄原料购自药材市场，难以溯源，存在具体产地、品种、加工工艺等信息不明确的问题，导致了不同批次粗提物间特征峰的峰面积差异较大，故试验没有对相对峰面积进行考察。4结论试验建立的可饲用植物姜黄粗提物的HPLC特征图谱分析方法，具有良好的精密性、重复性和稳定性。通过比较，确定8个特征峰，其中3个色谱峰分别被指认为双去甲氧基姜黄素、去甲氧基姜黄素、姜黄素。设定姜黄素作为参照峰（S峰），各个特征峰的相对保留时间RSD均在可接受范围，表明该方法满足要求，可用于鉴别单一型可饲用植物“姜黄粗提物饲料原料”，并能够对原料质量的均一性和真实性进行评价。