青海省特色野生植物黑果枸杞含有丰富的花青素。花青素别名花色苷，是水溶性类黄酮色素的重要亚类[1-2]。花青素具有降低心血管疾病的发生率等多种生物功效，特别是抗炎、抗氧化的功效得到广泛报道[3]。康雪燕[4]研究花青素对猪睾丸细胞的毒性和猪传染性胃肠炎病毒的作用，发现花青素对猪传染性胃肠炎病毒具有一定的治疗效用。Csernus等[5]研究发现，花青素可以改善受脂多糖LPS影响的肉鸡生长性能、炎症参数和肠道形态。Tian等[6]研究发现，花青素能够提高短链脂肪酸的产量，调节肠道微生物群结构。大量研究表明，氧化应激会引起心肌细胞的功能损伤，从而成为心血管等疾病的发病缘由[3]，而缺氧能够引起氧化应激对机体造成组织损伤。目前鲜见关于黑果枸杞花青素对心肌细胞氧化应激损伤的报道。因此，本试验探究黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞氧化应激损伤的影响，为深入研究黑果枸杞花青素改善氧化应激所引起的损伤及其相关分子机制提供参考，也为其对动物机体的免疫作用研究提供参考。1材料与方法1.1细胞来源本试验所用的H9c2大鼠心肌细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。1.2药物及试剂黑果枸杞花青素（纯度64.4%，青海金麦杞生物科技有限公司）；DMEM干粉、胎牛血清、双抗（Gibco公司）；PBS（Hfart公司）；胰蛋白酶EDTA溶液0.25%（Solarbio公司）；青霉素-链霉素混合液（武汉普诺赛生命科技有限公司）；RIPI（强）裂解液（陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司）。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超微量Ca2+-ATP酶、超微量Na+K+-ATP酶、总蛋白（TP）测定试剂盒由南京建成生物工程研究所生产；大鼠血红素氧合酶-1（HO-1）测定、大鼠白细胞介素-6（IL-6）、大鼠白细胞介素-10（IL-10）、大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）测定试剂盒由江苏酶免实业有限公司提供。1.3试验仪器超净工作台（江苏通净净化设备有限公司），台式电热恒温鼓风干燥箱及CO2细胞培养箱（美国NUAIRE公司），MIC-101细胞低氧小室-细胞缺氧-细胞高氧富氧培养仓（杭州Aipu Instrument Equipment有限公司），高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），酶标仪（意大利MuLTISKAN公司）。1.4细胞培养将H9c2大鼠心肌细胞置于37 ℃ 5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中进行常规培养（10%胎牛血清+1%双抗DMEM培养基），待细胞生长约70%~80%融合时进行传代，2~3 d进行一次细胞传代，培养足够的细胞。1.5细胞分组及处理将H9c2大鼠心肌细胞以每孔5×105个细胞接种于24孔板，每组3个复孔，分组处理后置细胞培养箱（37 ℃ 5% CO2 饱和湿度）中进行常规培养24 h后收集细胞。将培养好的心肌细胞分成常氧组、常氧+AC组、低氧组和低氧+AC组。常氧+AC组和低氧+AC组用50 mg/L AC预处理12 h，令细胞贴壁及生长到合适的细胞密度。常氧组与常氧+AC组放置CO2培养箱中常规培养24 h，低氧组与低氧+AC组放置细胞1%氧浓度低氧小室中低氧处理24 h。其中氧浓度使用MIC-101细胞低氧小室-细胞缺氧-细胞高氧富氧培养仓控制氧浓度，每组设置3个重复。1.6测定指标及方法1.6.1细胞抗氧化因子细胞计数后，以每孔1×105个接种于96孔板中，按上述分组进行试验，取各组细胞上清液，利用酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞上清液抗氧化因子CAT、MDA、SOD、GSH-Px、HO-1活性，试剂盒需提前20 min从冰箱中取出平衡至室温，按试剂盒说明书进行操作。1.6.2细胞能量代谢相关因子细胞计数后，以每孔1×105个接种于96孔板中，按上述分组进行试验，取各组细胞上清液，按检测试剂盒说明书进行处理，通过定磷法检测各组细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性。1.6.3细胞炎症因子细胞计数后，以每孔1×105个接种于96孔板中，按上述分组进行试验，取各组细胞上清液，采用酶联免疫吸附（ELISA）法检测细胞上清液炎性相关因子IL-6、IL-10、TNF-α的含量，试剂盒需提前20 min从冰箱中取出平衡至室温，按照试剂盒说明进行操作。1.7数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行初步处理，SPSS 26.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞抗氧化因子指标的影响（见表1）由表1可知，与常氧组相比，常氧+AC组大鼠心肌细胞CAT、HO-1活性显著升高（P0.05），GSH-Px、SOD活性均极显著升高（P0.01），MDA的含量显著降低（P0.05）；低氧组大鼠心肌细胞GSH-Px、HO-1活性均显著降低（P0.05），CAT、SOD活性均极显著降低（P0.01），MDA含量极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.014.T001表1黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞抗氧化因子活性的影响组别CAT/(U/mg prot)GSH-Px/(U/mg prot)SOD/(U/mg prot)MDA/(μmol/g prot)HO-1/(ng/L prot)常氧组170.01±13.87557.07±17.546.56±0.5612.59±0.58509.45±8.69常氧+AC组242.14±41.63a657.52±11.02A11.34±0.35A8.43±0.91a574.27±7.41a低氧组40.15±8.90A400.33±14.52a2.75±0.58A46.79±1.86A470.80±7.07a低氧+AC组70.82±11.87B493.5±12.71B23.34±0.55B27.51±0.52B508.88±10.86B注：数据肩标A表示与常氧组相比差异极显著（P0.01），肩标a表示与常氧组相比差异显著（P0.05）；肩标B表示与低氧组相比差异极显著（P0.01），肩标b表示与低氧组相比显著（P0.05）；下表同。与低氧组相比，低氧+AC组大鼠心肌细胞CAT、GSH-Px、SOD和HO-1活性均极显著升高（P0.01），MDA含量极显著降低（P0.01）。结果表明，黑果枸杞花青素可通过上调抗氧化因子CAT、GSH-Px、SOD、HO-1的生成并下调过氧化产物MDA的含量提高H9c2大鼠心肌细胞的抗氧化水平。2.2黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞能量代谢相关因子的影响（见表2）由表2可知，与常氧组相比，常氧+AC组大鼠心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性显著升高（P0.05）；低氧组大鼠心肌细胞Na+-K+-ATP酶活性显著降低（P0.05），Ca2+-ATP酶活性极显著降低（P0.01）。与低氧组相比，低氧+AC组大鼠心肌细胞Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性均极显著升高（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.014.T002表2黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞能量代谢相关因子活性的影响组别Na+-K+-ATP酶Ca2+-ATP酶常氧组1.82±0.241.89±0.44常氧+AC组2.76±0.46a2.82±0.31a低氧组0.64±0.11a0.41±0.17A低氧+AC组1.79±0.47B2.73±0.32BU/mg prot结果表明，低氧可抑制细胞内Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，黑果枸杞花青素可通过上调Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性改善低氧对H9c2大鼠心肌细胞ATP酶的损伤，并增强低氧下心肌细胞的能量代谢。2.3黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞炎症因子含量的影响（见表3）由表3可知，与常氧组相比，常氧+AC组大鼠心肌细胞促炎因子TNF-α、IL-6抗体含量均显著降低（P0.05），抗炎因子IL-10抗体含量极显著升高（P0.01）；低氧组大鼠心肌细胞促炎因子TNF-α、IL-6抗体含量均极显著升高（P0.01），抗炎因子IL-10抗体含量极显著降低（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.014.T003表3黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞炎症因子含量的影响组别TNF-α/(ng/L)IL-6/(μg/L)IL-10/(μg/L)常氧组14.69±1.1716.70±1.5511.25±0.54常氧+AC组11.10±0.83a12.04±1.03a16.78±0.46A低氧组182.75±5.11A248.79±1.06A5.54±0.52A低氧+AC组72.04±3.18B176.87±2.58B10.01±0.44B与低氧组相比，低氧+AC组大鼠心肌细胞促炎因子TNF-α、IL-6抗体含量均极显著降低，抗炎因子IL-10抗体含量极显著升高（P0.01）。结果表明，黑果枸杞花青素可通过抑制低氧诱导后的H9c2大鼠心肌细胞中促炎因子TNF-α、IL-6的分泌，促进抗炎因子IL-10的分泌，抑制低氧诱导的炎症的发生。3讨论3.1黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞抗氧化因子含量的影响氧化应激是活性氧生成与抗氧化防御系统之间失衡的结果[7-8]，能够导致心肌细胞损伤，从而引发心肌损伤性疾病[9-10]，影响机体能量代谢，引发炎症反应。MDA、CAT、SOD、GSH-Px是判断机体氧化应激反应的重要指标，MDA属于机体氧化应激后的产物，间接反映心肌细胞氧化应激损伤程度[11]。CAT、SOD、GSH-Px作为3种内源性抗氧化酶，可抑制机体内自由基生成[12-14]，上调CAT、SOD、GSH-Px氧化因子水平可缓解机体发生氧化应激后自由基的产生，提高清除自由基的能力，减少氧化应激对机体造成的损伤。HO-1是一种新发现的抗氧化酶，可以在氧化应激状态下被诱导产生，在氧化应激状态下，HO-1高度表达可以保护机体免受损伤[15]。本研究显示，在常氧状态下，加入黑果枸杞花青素，大鼠心肌细胞CAT、HO-1活性均明显升高，GSH-Px、SOD活性均极显著升高，MDA的含量明显降低，说明在常氧条件下，黑果枸杞花青素能够提高心肌细胞抗氧化能力。与常氧相比，低氧状态下心肌细胞内GSH-Px、HO-1活性均明显降低，CAT、SOD活性均极显著降低，MDA含量极显著升高，说明低氧导致心肌细胞氧化应激损伤。而加入黑果枸杞花青素后，低氧组心肌细胞的CAT、GSH-Px、SOD、HO-1活性均极显著升高，MDA含量极显著降低。研究表明，黑果枸杞花青素能够提高心肌细胞的抗氧化应激水平，减弱氧化应激造成的损伤。3.2黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞能量代谢相关因子的影响能量代谢作为机体正常生理活动的基本特征，是机体的一种新陈代谢方式[16]。然而，机体不能直接吸收利用营养物质中的能量，必须转化成高能磷酸化合物ATP储存在细胞中。当机体需要时，ATP酶将ATP催化水解成ADP释放出能量，为生理活动提供能量[17]。ATP酶主要存在于组织细胞或细胞器内膜上，保证细胞新陈代谢物质进出，对维持细胞稳态具有重要作用，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶作为细胞膜上最典型的蛋白酶，也是能量代谢水平的重要的指标。低氧状态下，心肌细胞ATP生成量减少，心肌细胞膜离子通道活动受到影响，导致细胞内钠离子增多。同时，Ca2+-ATP酶活性受到抑制，使心肌细胞内外钙离子失衡，导致心肌损伤。因此，保持Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性能够更好地维持细胞内Na+、Ca2+细胞离子平衡，从而保护心脏，减轻心肌损伤[18-20]。本研究结果显示，在常氧状态下，加入黑果枸杞花青素后，心肌细胞的Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性明显升高，说明在常氧下黑果枸杞花青素可以提高其能量代谢水平。与常氧相比，低氧状态下心肌细胞的Na+-K+-ATP酶活性明显下降，Ca2+-ATP酶活性极显著下降，说明低氧导致心肌细胞能量代谢下降。加入黑果枸杞花青素能够极显著提高心肌细胞中的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性。研究表明，黑果枸杞花青素能够通过提高心肌细胞中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性，增强低氧情况下心肌细胞能量代谢，维持细胞离子平衡，从而起到保护心肌的作用。3.3黑果枸杞花青素对H9c2大鼠心肌细胞炎症因子含量的影响炎症是机体对外界刺激的一种防御反应，但相应也会造成一定程度的自我损伤。机体受到氧化应激损伤，会增加炎性因子的产生[21]。由巨噬细胞和单核细胞分泌的TNF-α是参与机体炎症和免疫反应的重要的调节因子之一，可通过其他相关的细胞因子和增加血管通透性诱发局部炎症反应[22]。IL-6由心肌细胞自身产生[23]，能够产生细胞毒性，直接损伤心肌细胞[24]。IL-10是一种有效的抗炎细胞因子，产生于单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等细胞，可抑制促炎因子如TNF-α、IL-6等的合成，发挥抗炎作用[25-26]。本研究显示，在常氧状态下，加入黑果枸杞花青素，促炎因子TNF-α、IL-6含量均明显降低，IL-10含量极显著升高，说明黑果枸杞花青素能够提高心肌细胞抗炎能力。与常氧相比，低氧状态下促炎因子TNF-α、IL-6含量均极显著升高，抗炎因子IL-10含量极显著降低，说明低氧导致心肌细胞产生炎性反应，抑制抗炎因子IL-10分泌，减轻对促炎因子TNF-α、IL-6的抑制作用。加入黑果枸杞花青素的低氧组中促炎因子TNF-α、IL-6含量均极显著降低，抗炎因子IL-10含量极显著升高。研究表明，黑果枸杞花青素能够通过抑制心肌细胞中促炎因子TNF-α、IL-6表达，促进抗炎因子IL-10表达，降低低氧氧化应激所致细胞损伤的炎性反应。4结论本研究结果显示，黑果枸杞花青素能够通过提高CAT、GSH-Px、SOD、HO-1活性，降低MDA的含量提高H9c2大鼠心肌细胞的抗氧化水平；通过提高Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，增强低氧下心肌细胞的能量代谢；通过减少促炎因子TNF-α、IL-6的含量，增加抗炎因子IL-10含量，抑制低氧诱导的炎症反应。综上所述，黑果枸杞花青素能够缓解氧化应激所致的一系列损伤，对H9c2大鼠心肌细胞具有保护作用，可为黑果枸杞花青素对心肌细胞氧化损伤的影响研究提供参考，同时也为开发青海省黑果枸杞作为新型植物源免疫增强剂提供参考。