胆汁酸（BA）是胆汁的主要脂质成分，具有抑菌、乳化、免疫、营养及保护肝、肠功能等作用[1]。目前，BA作为促生长添加剂、抗氧化剂等广泛应用于水产动物养殖中。饲粮中添加适宜水平的BA对水产动物的生长性能、消化酶活性、机体代谢、免疫功能和肠道微生物区系[2-5]均具有积极影响；BA还参与凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的发病过程[6]。BA是虾蟹类维持正常生长不可缺少的营养物质，对蜕皮激素的生成具有促进作用。凡纳滨对虾是世界对虾养殖的三大品种之一，属于一种高蛋白低脂肪的优质虾种，具有较高的经济价值和营养价值。本试验探讨了BA对凡纳滨对虾生长性能、消化酶活性及免疫代谢相关基因表达的影响，为BA在水产养殖中应用及相关研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物及饵料试验用凡纳滨对虾由天津市晟淼水产养殖有限公司提供，体重（5.68±0.49）g。BA购自山东龙昌动物保健品有限公司，有效物质含量30%。基础饵料由天津凯源饲料有限公司生产，粒径1.0 mm，其组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.012.T001表1基础饵料组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100秘鲁鱼粉18粗蛋白质38.52舟山鱼粉9粗脂肪6.84发酵豆粕8粗纤维5.04膨化大豆粉3粗灰分12.37豆粕7水分8.37花生粕10钙2.01菜籽粕8磷1.67鱿鱼膏粉2玉米2麸皮3高筋面粉20虾壳粉6豆油1鱼油1复合维生素1矿物盐1注：1.复合维生素、矿物盐购自天津凯源饲料有限公司。2.营养水平均为实测值。%1.1.2主要仪器设备立式蒸汽灭菌器购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂，PCR扩增仪、Gel Doc EZ Imager凝胶成像系统购自美国伯乐公司，MIKRO 200R离心机、UNIVERSAL 320R冷冻离心机购自德国Hettich科学仪器公司；T6紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司。1.2试验设计选择450只凡纳滨对虾，随机分为5组，每组3个重复，每个重复30只虾，每个重复在一个容器中饲养（730 mm × 490 mm × 420 mm）。对照组、0.5 g/kg组、1.0 g/kg组、2.0 g/kg组、4.0 g/kg组分别在基础饵料中添加0、0.5、1.0、2.0、4.0 g/kg的BA。试验期4 w。1.3饲养管理饲养期间，投饲量按照对虾体重的4%~5%进行投喂，每天投喂3次。饲养期间连续充气，溶解氧6 mg/L，水温27~29 ℃，盐度18‰~20‰。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能养殖试验结束后，分别对各组凡纳滨对虾进行计数，测定体重，计算成活率、增重率、特定生长率。成活率=Nt/N0×100%(1)增重率=(Mt-M0)/M0×100%(2)特定生长率=(lnMt-lnM0)/t×100%(3)饵料系数=总投饵量/对虾总增重量(4)式中：N0为对虾初始数量；Nt为对虾试验末数量；M0为对虾初重（g）；Mt对虾末重（g）；t为试验天数。1.4.2消化酶活性凡纳滨对虾饥饿24 h，解剖，取出肝胰腺、胃和肠道，使用滤纸将表面水分吸干，分别称取适量样品，加入9倍体积预冷的生理盐水匀浆（冰浴），8 000 r/min、4 ℃离心10 min，取上清液，采用文献[7]方法略加修改，测定消化酶活性。1.4.3实时定量PCR检测对虾肝胰腺相关因子基因表达18S rRNA（内参）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、溶菌酶（LZM）、谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、Toll受体（TLR）、线粒体ATP合酶亚单位α前体（ATPase）和糜蛋白酶（chymotrypsin）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，其引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.012.T002表2免疫代谢相关因子基因的引物序列引物序列（5'→3'）长度/bp18s-FAACGCTCGTAGTTTGACTTCTGC20218s-RCACGACCATTCGGGCTGTASOD-FCGCGGATCCGATGGCTGAGGCAAAGGAA243SOD-RCCGGAATTCTGGGCAAACATCTGTGCTATCTCAT-FGGCTATGGTTCTCGTACTTCCAAGC164CAT-RGCATTGTATAGGTCCCTTGTTGCALZM-FGAAGCGACTACGGCAAGAAC213LZM-RAACCGTGAGACCAGCACTCTGST-FAAGATAACGCAGAGCAAGG146GST-RTCGTAGGTGACGGTAAAGATLR-FGACCATCCCTTTTACACCAGACT268TLR-RCCTCGCACATCCAGGACTTTTAATPase-FCCAAGTTCGAGCAGGAGTTC194ATPase -RGGTTCCCTAGCCTGTCTTCCchymotrypsin-FATCTTGAACAATCCATAAAGCACCT313chymotrypsin-RATGACGAACGACGACTGTGAC目的基因的检测采用StepOnePlusTM实时PCR系统（美国应用生物系统公司）。PCR程序按照文献[8]的方法进行。采用2-△△Ct方法分析基因的相对表达量。1.5数据统计与分析试验数据采用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1BA对凡纳滨对虾的生长性能的影响（见表3）由表3可知，随着饵料中BA水平升高，对虾的增重率、特定生长率和成活率均先增加后降低，2.0 g/kg组和4.0 g/kg组对虾的增重率和特定生长率显著低于其他组（P0.05），4.0 g/kg组对虾的成活率显著低于其他组（P0.05），且以1.0 g/kgBA添加组成活率最高。研究表明，对虾饵料中适量添加BA能够明显提高对虾生长性能，超量添加会妨碍对虾的生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.012.T003表3BA对凡纳滨对虾的生长性能的影响组别初重/g末重/g增重率/%特定生长率/(%/d)成活率/%饵料系数对照组5.53±0.528.78±0.7958.97±4.13a2.11±0.15a91.11±5.09a1.49±0.230.5 g/kg组5.76±0.599.42±1.5159.64±3.94a2.13±0.14a92.22±3.85a1.48±0.141.0 g/kg组5.81±0.589.72±0.6667.91±11.19a2.43±0.39a93.33±3.33a1.43±0.262.0 g/kg组5.69±0.488.63±0.9142.94±10.17b1.53±0.36b82.22±5.09a1.58±0.154.0 g/kg组5.45±0.267.25±1.2335.14±4.82b1.26±0.17b56.67±6.67b1.55±0.12注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5、表6与此同。2.2BA对凡纳滨对虾胃、肝胰腺、肠消化酶活性的影响（见表4）由表4可知，2.0 g/kg组、4.0 g/kg组对虾胃、肝胰腺、肠的蛋白酶活性显著低于其他组（P0.05）。2.0 g/kg组对虾胃和肝胰腺的淀粉酶活性显著低于对照组、0.5 g/kg组和1.0 g/kg组（P0.05），4.0 g/kg组对虾肝胰腺和肠道淀粉酶活性显著低于其他组（P0.05）。与对照组相比，0.5 g/kg组、1.0 g/kg组对虾胃、肝胰腺、肠的脂肪酶活性显著提高（P0.05）；2.0 g/kg组、4.0 g/kg组对虾肝胰腺和肠道的脂肪酶活性显著低于其他组（P0.05）。研究表明，适量BA（0.5、1.0 g/kg）能够提高对虾脂肪酶活性，对蛋白酶和淀粉酶活性影响较小，超量BA（2.0、4.0 g/kg）会降低3种消化酶活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.012.T004表4BA对凡纳滨对虾胃、肝胰腺、肠消化酶活性的影响项目对照组0.5 g/kg组1.0 g/kg组2.0 g/kg组4.0 g/kg组胃蛋白酶467.47±39.47a474.68±21.01a469.11±50.19a355.57±25.15b205.17±32.64c淀粉酶0.379±0.053a0.390±0.049a0.404±0.039a0.227±0.044b0.149±0.026b脂肪酶0.265±0.039b0.464±0.079a0.479±0.056a0.259±0.047bc0.186±0.035cd肝胰腺蛋白酶514.11±61.18a523.51±34.41a533.05±72.23a341.83±54.97b187.19±10.17c淀粉酶0.459±0.051ab0.421±0.029b0.517±0.037a0.218±0.016c0.141±0.022d脂肪酶0.478±0.041b0.671±0.082a0.695±0.133a0.311±0.037c0.214±0.032c肠蛋白酶271.02±31.99a285.29±35.08a295.58±24.91a251.71±27.39b188.98±23.92c淀粉酶0.291±0.019a0.269±0.023a0.294±0.041a0.237±0.031a0.162±0.036b脂肪酶0.372±0.037b0.479±0.032a0.553±0.069a0.251±0.024c0.165±0.031d注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。U/mg prot2.3BA对凡纳滨对虾肝胰腺免疫相关因子基因表达的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，0.5 g/kg组、1.0g/kg组对虾肝胰腺CAT和GST的基因表达水平显著上调（P0.05），1.0 g/kg组对虾肝胰腺TLR基因表达水平显著上调（P0.05），4.0 g/kg组对虾肝胰腺5种基因表达水平均显著下调（P0.05），2.0 g/kg组对虾肝胰腺CAT、TLR、GST基因表达水平显著下调（P0.05）。0.5 g/kg组、1.0 g/kg组对虾肝胰腺5种基因表达水平显著高于2.0 g/kg组及4.0 g/kg组（P0.05）。研究表明，适量添加BA（0.5、1.0 g/kg）能够提高对虾肝胰腺免疫相关基因的表达，超量BA会降低免疫相关基因的表达。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.012.T005表5BA对凡纳滨对虾肝胰腺免疫相关因子基因表达的影响组别SODCATLZMTLRGST对照组1.002±0.030ab1.001±0.034b1.001±0.025ab1.003±0.037b1.001±0.036b0.5 g/kg组1.224±0.204a1.739±0.219a1.195±0.230a1.169±0.185ab1.342±0.202a1.0 g/kg组1.039±0.114a1.577±0.169a1.224±0.216a1.294±0.149a1.425±0.226a2.0 g/kg组0.789±0.183b0.669±0.088c0.817±0.138b0.731±0.118c0.657±0.079c4.0 g/kg组0.372±0.048c0.481±0.076c0.358±0.065c0.444±0.054d0.352±0.069d2.4BA对凡纳滨对虾肝胰腺代谢相关因子基因表达的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，0.5 g/kg组、1.0 g/kg组对虾肝胰腺ATPase和chymotrypsin的基因表达水平显著上调（P0.05），4.0 g/kg组对虾肝胰腺ATPase和chymotrypsin的基因表达水平显著下调（P0.05）。0.5 g/kg组及1.0 g/kg组对虾肝胰腺ATPase和chymotrypsin的基因表达水平显著高于2.0 g/kg组、4.0 g/kg组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.012.T006表6BA对凡纳滨对虾肝胰腺代谢相关因子基因表达的影响组别ATPasechymotrypsin对照组1.003±0.042b1.001±0.036b0.5 g/kg组1.727±0.221a1.527±0.215a1.0 g/kg组1.988±0.366a1.604±0.181a2.0 g/kg组0.782±0.194bc0.844±0.123b4.0 g/kg组0.429±0.080c0.449±0.082c3讨论3.1BA对凡纳滨对虾生长性能的影响胆汁是一种黄绿色液体，在肝脏中由胆固醇产生，储存于脊椎动物的胆囊中，作为乳化剂可促进脂肪消化和脂溶性营养素吸收，能够促进胆固醇和有毒代谢物的排泄[9]。本试验条件下，适量BA（1.0 g/kg）对凡纳滨对虾生长具有明显的促进作用，在草鱼[5,10-11]、加州鲈[12-13]、花鲈[14]、大菱鲆[15]、大黄鱼[16-17]、齐口裂腹鱼[18-19]、军曹鱼[20]、异育银鲫[21]、吉富罗非鱼[22]、中华绒螯蟹[23]和凡纳滨对虾[24]的研究中也得到了证实。本试验发现，饵料中添加0.15 g/kg的BA可促进罗非鱼的脂质代谢，从而促进罗非鱼生长。但过量摄入BA会诱发胆结石形成，扰乱脂质代谢，降低罗非鱼的生长性能[25]。本研究也发现，超量添加BA可明显降低凡纳滨对虾的生长性能。3.2BA对凡纳滨对虾消化酶活性的影响甲壳动物消化酶的活性与其食性、发育阶段、营养、温度、pH值、盐度等诸因素密切相关。BA可显著提高吉富罗非鱼肝脏和肠道中的脂肪酶活性，对蛋白酶也具有一定影响[25]。翟少伟等[22]发现，300 mg/kg的BA可显著提高吉富罗非鱼肠道脂肪酶和蛋白酶活性；草鱼肠道及肝胰脏的消化酶活性均随BA添加量的增加呈先升高后下降的趋势，且均高于对照组[11]。低鱼粉饵料中添加0.5%、1.0% BA可有效提高中华绒螯蟹肝胰腺、肠道的总蛋白酶和脂肪酶活力[23]。随着高脂饵料中BA水平增加，齐口裂腹鱼肝胰腺蛋白酶活性、肝胰腺和前肠中的脂肪酶活性先升高后降低，前肠和中肠中的蛋白酶活性、中肠中的脂肪酶活性逐渐升高，且BA对后肠蛋白酶和脂肪酶活性以及前肠、中肠、后肠和肝胰腺淀粉酶活性无明显影响[19]。草鱼肠道各段及肝胰脏的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均随BA添加量的增加呈先升高后下降的趋势[10]。本研究发现，饵料中添加适量BA对凡纳滨对虾蛋白酶和淀粉酶活性影响较小，但可显著提高对虾的脂肪酶活性，可能是BA盐作为乳化剂乳化脂肪，使脂肪乳化成微滴，增加了胰脂肪酶的作用面积。本试验还发现，超量BA对于对虾的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性均具有显著的抑制作用。3.3BA对凡纳滨对虾免疫代谢相关基因表达的影响CAT、GST以及TLR为虾蟹类肝胰腺的重要免疫因子，在甲壳动物免疫防御中具有重要作用，ATPase和chymotrypsin在虾蟹动物的生理代谢中起重要作用。草鱼低蛋白高脂饵料中添加适宜水平BA，上调了草鱼肠道SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、GST和谷胱甘肽还原酶（GR）基因表达和活力，从而提高抗氧化损伤能力[11]。1 500 mg/kg BA能够显著激活大口黑鲈肝脏中丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（ERK1/2），参与调节细胞增殖、分化、迁移等多种生理过程，在调节炎症反应及细胞存活、凋亡环节中具有关键调控功能[26]。高脂饵料组中，添加BA显著升高了红鳍东方鲀肝脏CAT的基因表达量[27]。本研究结果显示，添加1.0 g/kg BA显著提高了凡尔滨对虾肝胰腺中CAT、TLR、GST、ATPase和chymotrypsin的基因表达水平，推测适量的BA能够提高凡纳滨对虾的抗氧化能力和消化能力。4结论本研究结果表明，饵料中添加1.0 g/kg BA可以增强凡纳滨对虾脂肪酶活性，上调免疫和代谢相关因子的基因表达，从而提高对虾的生长性能。过量添加BA（4.0 g/kg）会降低消化酶活性、肝胰腺免疫和代谢相关因子的基因表达，从而降低对虾的生长性能。