马的盲肠约占消化道的38%~40%。十二指肠、空肠和回肠的pH值分别为6.32、7.10和7.47；而盲肠和结肠的pH值略有下降，分别为6.70和6.67[1]。盲肠内容物和粪便中有400~500种微生物，数量可达1010~1012 CFU/g[2]。马肠道中厌氧菌主要有革兰氏阳性菌、噬纤维菌、屈挠杆菌及梭菌，其次还有螺旋菌、大肠杆菌、链球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌及纤维求菌[3]。盲肠和结肠中30%~80%菌群属于厌氧菌，总厌氧菌可达到1.85×107~2.65×109 CFU/mL[4-5]。Costa等[6]利用16S rDNA检测法发现马匹消化道主要菌群为厚壁菌门（Firmicutes）（68%），其次是拟杆菌门（Bacteroidetes）（14%）和变形杆菌门（Proteobacteria）（10%）。消化道微生物参与动物的消化、吸收及合成[7]，消化道微生物区系组成与动物的运动能力相关[8-9]。唾液乳酸杆菌亚种Salicinius（SA-03）可显著改善运动后的肌肉力量和耐力性能、增加肝脏和肌肉糖原的储存，并降低乳酸、血尿素氮（BUN）、氨和肌酸激酶（CK）的水平。SA-03可以用作营养补充品，以增强运动能力并减少运动损失[10]。植物乳杆菌（L. plantarum，LP10）可以有效增加小鼠的抓地力和耐力游泳时间，降低血清乳酸、氨、肌酸激酶和急性运动后血糖水平。采用LP10处理后，腓肠肌中I型纤维（慢肌）的数量显著增加，血清白蛋白、血尿素氮、肌酐和三酰甘油水平显著降低。长期补充LP10可能会增加肌肉质量、增强能量吸收，可以促进健康、改善性能和抗疲劳[11]。乳杆菌（Lactobacillus plantarum）TWK10以剂量依赖性方式显著提高运动性能、改善与疲劳相关的特征、显著减少体脂、显著增加肌肉质量[12]。Scheiman等[13]研究发现，马拉松后运动员韦荣氏球菌属（Veillonella）相对丰度增加，并从粪便样本中分离出一株非典型韦荣氏菌（Veillonella atypica）的菌株。将这种菌株接种到小鼠中会显著增加疲劳跑步机运行时间。非典型韦荣氏菌（Veillonella atypica）通过运动诱导的乳酸向丙酸的代谢转化来改善跑步时间，从而增强运动性能。迄今为止，在欧洲联盟中，只有不同菌株的酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）才被正式注册为马用益生菌[14]。试验以速度赛纯血马为研究对象检测粪便中微生物群落的多样性，为研究开发速度赛纯血马的微生物制剂提供参考。1材料与方法1.1样品来源马粪样本来自9匹现役纯血马，赛马由北京某马术俱乐部提供。赛马一个月内的比赛成绩及样本分组情况见表1，马匹组间竞技速度差异见表2。所有提供粪便样本的赛马，本年度饲养管理条件相同，训练强度相同，近90 d内无使用抗生素记录。采集样本前的日粮成分为羊草、苜蓿草、商品速度马商品饲料。商品饲料主要成分为燕麦、大麦、玉米片、黄豆、黑豆、油葵、米糠、燕麦糠、苜蓿草颗粒、糖蜜、食用大豆油。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.T001表1提供马粪样本的马匹信息个体编号健康状况成绩/(m/s)性别身高/cmA1良好16.785 6公161A2良好16.795 0母154A3良好16.849 2母166B4良好16.451 9公153B5良好16.409 6公164B6良好16.429 4母168C7良好16.254 9公170C8良好16.302 1公162C9良好16.390 8公15510.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.T002表2各组比赛成绩组别马匹组成成绩/(m/s)A组A1、A2、A316.809 9±0.034 3AaB组B4、B5、B616.430 3±0.021 2BbC组C7、C8、C916.315 9±0.069 0Bc注：同列数据肩标小写字母不同表示差异显著（P＜0.05）；大写字母不同表示差异极显著（P＜0.01）；下表同。1.2试验方法1.2.1马粪样品的采集休赛期后一周上午9：00采集马粪样品。每采集一份样本，更换一次手套。用手抓取中部粪便样本，用经火焰消毒的药匙取粪团中央的部分，放入无菌自封袋中密封保存，将样品迅速放-78.5 ℃干冰的保温箱中，带回实验室后放入-80 ℃保存。1.2.2DNA的提取采用美国Omega Biotek Inc公司生产的omega M5635-02试剂盒提取粪便样本微生物总DNA。提取完成后，采用紫外分光光度计（Thermo Scientific，NC2000）定量DNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。1.2.316S rDNA V3V4区PCR扩增及Illumina平台测序测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。根据16S rDNA的V3区，设计出通用引物，扩增所有细菌的16S rDNA片段，使用的通用引物序列为：前引物序列5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'；后引物序列5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。扩增体系（25 μL）：5×reaction buffer 5 μL、5×GC buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2 μL、Forwardprimer（10 μmol/L）1 μL、Reverseprimer（10 μmol/L）1 μL、DNA Template 2 μL、ddH2O 8.75 μL、Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。扩增参数：Initial denaturation 98 ℃、2 min，Denaturation 98 ℃、15 s，Annealing 55 ℃、30 s，Extension 72 ℃、30 s，Final extension 72 ℃、5 min，10 ℃ Hold 25~30个循环。将PCR扩增产物回收并进行荧光定量。荧光试剂为Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit，定量仪器为Microplate reader（BioTek，FLx800）。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。构建Illumina平台文库，对样品采用Illumina MiSeq平台对群落DNA片段进行双端(Paired-end)测序。1.3数据统计与分析采用QIIME2（2019.4）软件、R脚本等进行物种分类学注释、构建发育树，进行分类学组成、Alpha多样性、Beta多样性、物种差异与标志物种等的分析。采用PICRUSt2、R脚本及在线数据库进行功能潜能预测分析。组间差异用SPSS Statistics 25.0 LSD法分析。2结果与分析2.1马粪样本的微生物组成（见表3~表5）由表3可知，3组粪便样本微生物总特征序列、微生物分类所属的门、目、科、属菌群数量无显著差异（P＞0.05），A组在纲、种分类的菌群数显著高于C组（P＜0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.T003表3马粪便菌群的分类组成 （n=3）项目A组B组C组总ASV5 927±4246 391±6056 049±723门17±116±117±1纲28±2a26±1ab25±1b目37±437±234±3科51±651±844±4属65±1159±1155±5种23±2a21±2ab19±2b由表4可知，在分类门、纲、目、科、属中分别获得4、3、5、9、14组微生物差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.T004表4赛马粪便微生物属分类单元丰度差异名称A组B组C组K. bacteria; P. actinobacteria; C. coriobacteriia; O. coriobacteriales;F. coriobacteriaceae; G. unclassified Coriobacteriaceae2.453×10-3±5.220×10-4ABa2.938×10-3±5.720×10-4Aa1.335×10-3±4.690×10-4BbK. bacteria; P. armatimonadetes; C. SJA-176; O. RB046;F. unidentified RB046; G. unidentified RB0463.000×10-5±4.100×10-5b1.700×10-4±5.300×10-5a1.150×10-4±5.600×10-5abK. bacteria; P. bacteroidetes; C. bacteroidia; O. bacteroidales;F. [paraprevotellaceae]; G. [prevotella]1.365×10-3±7.090×10-4b4.805×10-3±2.345×10-3a2.028×10-3±6.960×10-4abK. bacteria; P. fibrobacteres; C. fibrobacteria; O. fibrobacterales; F. fibrobacteraceae; G. fibrobacter9.480×10-4±1.860×10-4Bb2.942×10-3±4.510×10-4Aa1.407×10-3±6.190×10-4BbK. bacteria; P. firmicutes; C. clostridia; O. clostridiales; F. lachnospiraceae; G. pseudobutyrivibrio4.277×10-3±4.56×10-4a2.262×10-3±1.478×10-3b1.756×10-3±5.830×10-4bK. bacteria; P. firmicutes; C. clostridia; O. clostridiales;F. Lachnospiraceae; G. unclassified Lachnospiraceae1.833×10-2±1.820×10-3ABb2.965×10-2±6.521×10-3Aa15791×10-2±1.869×10-3BbK. bacteria; P. Firmicutes; C. Clostridia; O. Clostridiales;F. Lachnospiraceae; G. unidentified Lachnospiraceae0.102±0.020ab0.119±0.012a0.086±0.012bK. bacteria; P. Firmicutes; C. Clostridia; O. Clostridiales; F. Veillonellaceae; G. Anaerovibrio1.395×10-3±5.500×10-4a8.080×10-4±2.93×10-4ab4.930×10-4±9.400×10-5bK. bacteria; P. Firmicutes; C. Clostridia; O. Clostridiales;F. [Mogibacteriaceae]; G. unidentified [Mogibacteriaceae]0.016±0.002ab0.019±0.005a0.012±3.280×10-4bK. bacteria; P. Firmicutes; C. erysipelotrichi; O. erysipelotrichales; F. erysipelotrichaceae; G. unclassified Erysipelotrichaceae6.590×10-4±2.680×10-4ab5.480×10-4±4.290×10-4b1.339×10-3±3.620×10-4aK. bacteria; P. Proteobacteria; C. alphaproteobacteria; O. Rhizobiales; F. Brucellaceae; G. Ochrobactrum3.400×10-5±1.500×10-5ABb7.200×10-5±7.000×10-6Aa9.000×10-6±1.500×10-5BcK. bacteria; P. Proteobacteria; C. gammaproteobacteria;O. Enterobacteriales; F. Enterobacteriaceae; G. unclassified Enterobacteriaceae1.300×10-5±2.200×10-5b1.182×10-3±9.600×10-4a3.400×10-5±1.500×10-5bK. bacteria; P. Verrucomicrobia; C. Verruco-5; O. WCHB1-41; F. WCHB1-25; G. unidentified WCHB1-254.250×10-4±1.920×10-4a7.200×10-5±9.400×10-5b1.190×10-4±4.800×10-5bK. bacteria; P. unclassified bacteria; C. unclassified bacteria;O. unclassified bacteria; F. unclassified bacteria; G. unclassified bacteria1.981×10-3±7.170×10-4b2.521×10-3±2.602×10-4ab3.261×10-3±6.720×10-4a由表5可知，A、B和C组之间赛马粪便微生物丰度在门水平上厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度无显著差异（P＞0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.T005表5赛马粪便中厚壁菌门与拟杆菌门丰度比值差异分类等级名称A组B组C组门Firmicutes/Bacteroidetes8.130±1.8984.748±2.1477.094±4.8642.2马粪样本微生物的Alpha多样性（见图1）由图1可知，丰富度Chao1和Observed species指数、多样性Shannon、Simpson指数以B组最高。反映进化多样性的Faith's PD指数B组最高，C组接近B组，A组最低。均匀度指标Pielou's evenness指数以B组最高，A组次之，C组最低。覆盖度指标Good's coverage指数以B组最高，C组和A组次之。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.F001图1Alpha多样性指数的分组箱线图2.3马粪样本微生物的Beta多样性（见图2）由图2可知，A组和C组各自两个样本比较接近，两者距离也较为接近。B组的与A组和C组均有一定距离，3个样本之间的距离也较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.F002图2PCoA分析的样本二维排序图2.4马粪样本中微生物菌群的差异（见图3~图6）由图3可知，A、B两组共有微生物菌群4 656个，A、C两组共有微生物菌群4 522个，B、C两组共有微生物菌群4 398个，A、B、C三组共有微生物菌群3 085个。A、B、C独有的微生物分别为8 215、9 895和9 382个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.F003图3基于ASV的维恩图由图4可知，通过PCA分析，A、C两组样本在坐标轴上的投影最近，微生物物种丰度组成在相应维度中相似，而B组距离较远，与A、C两组样本微生物丰度组成差异较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.F004图4PCA分析的马粪微生物物种载荷图和马粪样本二维排序图由图5可知，A组标志物种Bacteria、Firmicutes、Clostridia、Clostridiales、Veillonellaceae、Anaerovibrio在三组马粪样本分组中的相对丰度分布为A组＞B组＞C组。C组标志物种Bacteria、Proteobacteria、Alphaproteobacteria、Rhizobiales在各组中的丰度分布依次为C组＞B组＞A组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.F005图5标志物种在不同分组中的相对丰度分布注：实线为该分类单元在每一分组中相对丰度平均值，虚线为中位值。由图6可知，通过LDA效应值分析，A组的厌氧弧菌属（Anaerovibrio）、C组的根瘤菌目（Rhizobiales）在样本分组中的特异性高、差异显著（P＜0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.016.F006图6标志物种的LDA效应值3讨论3.1速度赛马肠道微生物群落多样性利用16S rDNA高通量测序技术能够准确性、高通量、高灵敏度地通过肠道微生物群落的稳定性和多样性的变化反映动物的胃肠道健康和生长发育情况[15]。Proudman等[16]对8匹优势纯血马的14份粪样进行测序，共获得有效序列488 213条，OTUs的平均范围为1 200~3 000个。Zhao等[17]对14匹蒙古马和19匹纯种马的33份粪样进行测序，共获得有效序列数593 678条，属于16个门和75个属。厚壁菌门（Firmicutes）（蒙古马中的56%，纯血马中的53%）和拟杆菌门（Bacteroidetes）（分别为33%和32%）是最丰富的种，其次是Spirochaete，Verrucomicrobia，Proteobacteria和Fibrobacteres。O' Donnell等[18]对爱尔兰纯种赛马6份粪便样品进行测序，共获得有效序列178 975条，共有19个门，229属，以坚韧菌、拟杆菌、变形杆菌、疣状微生物、放线菌、真细菌、真细菌、纤毛虫和螺旋藻占支配地位。Costa等[19]采用高通量测序技术研究马不同肠道不同区段细菌落组成及多样性，发现其在门水平上主要为厚壁菌门。Dougal等[20]研究表明，在纯血马和矮种马的粪便中厚壁菌门、拟杆菌门、螺旋体菌门、变形菌门和放线菌门为主要优势菌。对牛、野马、灵长类动物等进行研究，发现厚壁菌门和拟杆菌门是其胃肠道主要的优势菌群[21-23]。本试验测序获得9匹速度赛纯血马9个粪样细菌16S rDNA有效序列数平均16 122条，共检测到25个门，49个纲，86个目，149个科，254个属的细菌，而马粪中存在0.56%的细菌16S rDNA序列未归类。本试验获得的有效序列高于Zhao等[17]的检测结果，但低于O' Donnell等[18]的检测结果；分类归属门和属的微生物数，均高于Zhao等[17]和O' Donnell等[18]的结果。本试验检测到厚壁菌门、拟杆菌门、疣微菌、螺旋体菌门、变形菌门、无壁菌门、放线菌门、TM7、纤维杆菌门、SR1丰度占98%以上。其中，厚壁菌门（53%）、拟杆菌门（42%）、疣微菌门（1%）为主要的优势菌门，占微生物总数的96%，其他细菌门的贡献为4%，与Zhao等[17]检测结果相近，但所占比例有差异。由此看出，不同品种马的消化道微生物区系有一定差异。3.2消化道微生物区系对速度赛马竞技速度的影响消化道微生物区系影响人和动物对营养成分的消化吸收和脂肪沉积。Jumpertz等[24]研究发现，胖人厚壁菌门与拟杆菌门丰度比值明显高于瘦人；将具有这种特征性丰度的胖小鼠和瘦小鼠肠道菌移植到无菌鼠，两周后，移植了胖小鼠菌群的无菌鼠的体内脂肪重量比移植了瘦鼠肠道菌的增加了20%。厚壁菌门和拟杆菌门的相互竞争关系，影响促进养分吸收和调节宿主肥胖基因[25]。本试验中，对厚壁菌门与拟杆菌门丰度比值进行对比分析，3组马匹之间无显著差异，说明速度差异不是由于厚壁菌门与拟杆菌门之间关系引起的。消化道菌群能改善剧烈运动中代谢和能量消耗[26]。本试验中，隶属于厚壁菌门的毛螺旋菌科、杆菌科（Mogibacteriaceae），隶属于拟杆菌门的Paraprevotellaceae及疣微菌门的WCHB1-25，在B组与C组之间差异显著。研究表明，毛螺旋菌科中的多个菌属为丁酸生成菌属，可以发酵纤维物质产生丁酸，促进盲肠防御素基因的表达，从而有效地抑制病原微生物侵袭[27]，可以抗肠炎[28]。同时，消化道微生物代谢产物短链脂肪酸促进骨骼肌葡萄糖的摄入和代谢[29]，丁酸可提高肌纤维的能量代谢效率[30]。因此，推测上述微生物对赛马的竞技速度有贡献。本试验中，厌氧弧菌属（Anaerovibrio）在A组中特异性高、标志物种的LDA效应值显著。Prins等[31]研究发现，厌氧弧菌属（Anaerovibrio）的菌株，可以发酵核糖、甘油和DL-乳酸，其对甘油的发酵产物是丙酸酯和琥珀酸酯，而对核糖、果糖和DL-乳酸主要发酵产物为乙酸酯、丙酸酯和二氧化碳。厌氧弧菌属的代谢产物是否会对肌纤维能量代谢产生影响，进而对赛马的竞技速度产生影响，尚待研究。3.3安全性与展望目前很多益生菌菌株被长期应用在生产和生活中，被人们公认为安全菌种[32-33]。但是，不能确保每一种新型益生菌都与传统菌株一样具有相同的安全性[34]。尽管乳酸菌（Lactobacilli）应用较成熟，没有致病报道，但不能完全排除任何活微生物引起感染的可能性[35]。在免疫功能低下的患者，使用乳杆菌和肠球菌菌株后，少数人出现不良反应（如心内膜炎，菌血症，肺炎，脑膜炎和化脓性关节炎等罕见病例）[36]。因此，将这些菌株用于人或动物食用之前，需要评估益生菌的安全性，特别是没有确定安全性的新型菌株，应彻底评估益生菌是否存在任何种类的致病性状或毒力特性。根据本试验研究结果开发的提高赛马竞技速度的微生物制剂，也需要对相应的微生物进行安全性评估。4结论本试验采用 Illumina MiSeq测序技术获得9匹赛马9个粪样的有效序列55 102条，平均ASVs 16 122个。A组与C组粪便微生物菌群之间在纲、种的分类菌群数上差异显著，Alpha多样性、Beta多样性无显著差异。LDA效应分析获得A组马粪微生物标志物种为Bacteria、Firmicutes、Clostridia、Clostridiales、Veillonellaceae、Anaerovibrio，在3个样本组中的相对丰度分布为A组＞B组＞C组；A组的厌氧弧菌属（Anaerovibrio）、C组的根瘤菌目（Rhizobiales）的LDA效应值显著。按马粪中微生物丰度，纲、目、科、属中分别有4、3、5、9、14组微生物差异，各组之间厚壁菌门与拟杆菌门丰度比值无显著差异。可根据本试验的结论筛选出提高赛马成绩的消化道微生物制剂。