水产诱食剂凭借特有的气味吸引水产动物聚集、增加动物食欲。诱食剂可以通过刺激水产动物的感觉器官提高水产动物的摄食率、降低饲料系数、减少对环境的二次污染[1-3]。陈京华等[4]研究发现，基础饲料中添加1%诱食剂，可以显著提高牙鲆的摄食率、饲料效率、鱼体脂肪含量以及肝脏、肠胰蛋白酶活力和肠氨肽酶活力。凡纳滨对虾是我国主要的对虾养殖品种之一[3]，但是养殖过程中存在饲料适口性差、饲料浪费等问题[5]。研究人员对凡纳滨对虾诱食剂的研究取得了较好的效果[3,6-9]。基于前期凡纳滨对虾诱食物质的筛选，试验探讨复合诱食剂对凡纳滨对虾生长性能、消化酶活性与肠道菌群组成的影响，以期为凡纳滨对虾的绿色健康养殖提供参考。1材料与方法1.1试验材料凡纳滨对虾购自天津市宝坻区渔翁水产科技发展有限公司，体质量（4.53±0.44）g。复合诱食剂（Compound feed attractant，CFA）主要组分为山奈、甘草、阿魏、肉桂、甾醇、葡萄糖、鱿鱼膏。基础饲料由天津凯源饲料有限公司生产，粒径1.0 mm。基础饲料营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.T001表1基础饲料营养水平项目含量粗蛋白质38.61粗脂肪7.83粗灰分10.36粗纤维5.28水分7.69钙2.34磷1.55%设备：立式蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）、PCR扩增仪和Gel Doc EZ Imager凝胶成像系统（美国伯乐公司）、MIKRO 200R离心机和UNIVERSAL 320R台式冷冻离心机（德国Hettich科学仪器公司）、T6紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。1.2试验方法1.2.1试验设计试验选择360只体况相近的对虾，设置对照组、3个试验组（0.5%CFA、1.0%CFA和1.5%CFA），分别用control组、CFAⅠ组、CFAⅡ组和CFAⅢ组表示。每组3个重复。凡纳滨对虾饲养容器规格730 mm×490 mm×420 mm，每个容器投放30只对虾。1.2.2饲养管理养殖期间按照对虾体重的3%~5%投喂饲料，投喂时间：8：00、14：00和20：00。养殖期间持续充气保持溶解氧6 mg/L、水温27~29 ℃、盐度8~9，饲养28 d。1.2.3生长指标测定养殖试验结束后对凡纳滨对虾进行计数和体质量测定，生长性能计算公式如下：成活率(SR)=Nt/No×100%(1)增重率(WGR)=[(Mt-Mo)/Mo]×100%(2)特定生长率(SGR)=[(lnMt-lnMo)/t]×100%(3)饲料系数=总投饵量/对虾总增重量(4)式中：No和Nt为初始个体数量（只）和终末个体数量（只）；Mo和Mt分别为初重和末重（g）；t为试验天数（d）。1.2.4对虾消化酶活性测定1.2.4.1样品处理与蛋白质浓度测定养殖结束后解剖凡纳滨对虾，取出肝胰腺、胃和肠道，去除胃肠道内容物并且吸干表面水分，分别称重。加入9倍体积预冷的生理盐水匀浆（冰浴），8 000 r/min、4 ℃离心10 min。取上清液作为酶粗提液，4 ℃储存备用。虾肝胰腺和胃肠道组织中蛋白质浓度用北京索莱宝科技有限公司生产的BCA蛋白浓度试剂盒测定。1.2.4.2蛋白酶2%干酪素（0.1 mol/L）磷酸盐缓冲液（pH值8.0）1 mL、1%酶粗提液1 mL混匀。其他操作按照文献[10]进行。蛋白酶活性以1 mg蛋白质的酶液每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位（U）。1.2.4.3淀粉酶1.0%可溶性淀粉（0.1 mol/L）磷酸盐缓冲液（pH值7.0）1 mL，加入0.1 mL酶粗提液，37 ℃水浴中反应30 min。其他操作按照文献[10]进行。淀粉酶活性以1 mg蛋白质的酶液每分钟水解淀粉产生1 mg麦芽糖为1个酶活力单位（U）。1.2.4.4脂肪酶脂肪酶测定参照刘玉梅等[11]测定方法进行。脂肪酶活性以1 mg蛋白酶液1 min水解底物产生1 μmol的可滴定脂肪酸为1个酶活性单位（U）。1.2.5凡纳滨对虾肠道菌群分析养殖结束后禁食24 h，每组随机选取4尾对虾。采用75%的酒精擦拭消毒，无菌操作条件下解剖取出完整肠道，送至北京诺禾致源科技股份有限公司进行、16S rDNAV34区测序分析。1.3数据统计与分析试验采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，数据结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1复合诱食剂对凡纳滨对虾生长性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，CFAⅡ组凡纳滨对虾的增重率和特定生长率显著提高、饲料系数显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.T002表2复合诱食剂对凡纳滨对虾生长性能的影响项目对照组CFAⅠ组CFAⅡ组CFAⅢ组初重/g4.58±0.374.54±0.454.49±0.594.52±0.61末重/g10.49±0.6411.58±1.2312.87±2.0211.47±1.22增重率/%129.17±11.05155.71±24.08187.13±34.19*156.39±42.76特定生长率/（%/d）2.96±0.173.34±0.333.75±0.42*3.33±0.59养殖成活率/%87.78±5.0990.00±6.6793.33±3.3392.22±3.85饲料系数1.22±0.021.12±0.051.08±0.08*1.10±0.09注：*表示同行数据差异显著（P0.05）；下表同2.2复合诱食剂对凡纳滨对虾消化酶活性的影响（见表3、表4）由表3、表4可知，与对照组相比较，CFAⅠ组中凡纳滨对虾肝胰腺组织中淀粉酶和脂肪酶活性显著升高（P0.05），CFAⅡ组中凡纳滨对虾肝胰腺和胃肠道组织中蛋白酶和脂肪酶及胃肠道淀粉酶活性显著增强（P0.05），CFAⅢ组中凡纳滨对虾肝胰腺蛋白酶和胃肠道脂肪酶活性也显著升高（P0.05）。相比较而言，1.0%复合诱食剂提高对虾消化酶活性的效果最好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.T003表3不同处理组南美白对虾肝胰腺消化酶活性的比较项目对照组CFAⅠ组CFAⅡ组CFAⅢ组淀粉酶活性0.360±0.0370.437±0.029*0.387±0.0210.371±0.030蛋白酶活性602.200±50.190636.170±64.560837.640±68.040*767.000±70.220*脂肪酶活性0.328±0.0310.413±0.034*0.499±0.046*0.364±0.034U/mg prot10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.T004表4不同处理组南美白对虾胃肠道消化酶活性的比较项目对照组CFAⅠ组CFAⅡ组CFAⅢ组淀粉酶活性0.312±0.0300.333±0.0320.367±0.030*0.326±0.022蛋白酶活性123.530±15.030141.890±13.540222.780±22.040*140.700±15.050脂肪酶活性0.628±0.0660.687±0.0640.844±0.078*0.799±0.086*U/mg prot2.3复合诱食剂对凡纳滨对虾肠道菌群组成的影响基于Illumina HiSeq测序平台对不同处理组凡纳滨对虾肠道菌群组成进行分析比较。2.3.1不同处理组凡纳滨对虾肠道菌群的OTUs韦恩图（见图1）韦恩图可以直观反映多个样本或多组样本元素组成方面的异同，是反映肠道菌群结构差异的重要手段[11]。一致性达到97%被认为可能源自同一个种的序列，将其聚类成为一个OTU的序列[12]。由图1可知，CFAⅠ组对虾肠道具有716个特有OTU（对照组390个），CFAⅡ组对虾肠道具有766个特有OTU（对照组367个），CFAⅢ组对虾肠道具有579个特有OTU（对照组378个）。可见，饲料中添加复合诱食剂后，凡纳滨对虾肠道中特有的OTU数明显增多。图1不同处理组凡纳滨对虾肠道菌群的OTUs韦恩图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.F001（a）0.5%诱食剂组与对照组对虾肠道菌群的韦恩图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.F002（b）1.0%诱食剂组与对照组对虾肠道菌群的韦恩图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.F003（c）1.5%诱食剂组与对照组对虾肠道菌群的韦恩图2.3.2复合诱食剂对凡纳滨对虾肠道菌群物种相对丰度的影响（见图2）将注释结果在不同分类水平上按照丰度进行排序，选取每个组别在属分类水平上最大丰度排名前10的物种，生成物种相对丰度柱形图。由图2可知，对照组凡纳滨对虾肠道Spongiimonas属相对丰度最大，为44.16%，弧菌属（Vibrio）、希瓦氏菌属（Shewanella）和芽孢杆菌（Candidatus bacilloplasma）的相对丰度分别为13.50%、14.8%和2.02%，其他菌属（Others）为24.45%；CFAⅠ组对虾肠道噬冷菌属（Algoriphagus）、瘤胃球菌属（Ruminococcaceae）、希瓦氏菌属、Haloferula和副球菌属（Paracoccus）的相对丰度分别为26.41%、9.58%、5.6%、4.03%和3.7%，其他菌属为46.26%；CFAⅡ组对虾肠道的瘤胃球菌属、噬冷菌属、副球菌属和Haloferula的相对丰度分别为12.2%、8.15%、7.24%和3.6%，其他菌属为60.12%；CFAⅢ组对虾肠道的弧菌属、瘤胃球菌属、芽孢杆菌和噬冷菌属的相对丰度分别为22.78%、10.34%、7.35%和3.87%，其他菌属为43.91%。诱食剂组对虾肠道其他菌属的相对丰度均高于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.F004图2不同处理组凡纳滨对虾肠道菌群中属水平以上的物种相对丰度柱形图2.3.3复合诱食剂对凡纳滨对虾肠道菌群α-多样性指数的影响（见表5）由表5可知，处理组凡纳滨对虾肠道菌群Shannon、Simpson、Chao1指数、ACE指数均明显高于对照组。CFAⅠ和CFAⅡ组凡纳滨对虾肠道菌群谱系多样性指数明显高于对照组，CFAⅡ组凡纳滨对虾肠道菌测序深度指数略高于对照组，而CFAⅢ组凡纳滨对虾肠道菌群谱系多样性指数略低于对照组。复合诱食剂能够明显提高凡纳滨对虾肠道菌群的多样性水平。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.011.T005表5不同处理组凡纳滨对虾肠道菌群α-多样性指数比较项目对照组CFAI组CFAII组CFAIII组物种数目72010461119921Shannon3.9876.3527.6696.355Simpson0.7800.9200.9820.940Chao1指数781.1351 099.1761 121.939968.559ACE指数780.5101 099.5131 121.737967.587测序深度指数0.9980.9980.9990.998谱系多样性指数70.11173.44087.90668.0543讨论有研究表明，将两者或多种诱食物质一同使用可以显著性提高诱食效果[13-14]。中草药中含有多种天然活性物质、天然易得、药性温和，在饲料添加剂行业中有着较好的应用前景[15-17]。季延滨等[8]对16种中草药进行诱食筛选，发现凡纳滨对虾对山萘、丁香、八角、肉桂等摄食偏向更显著。胡俊茹等[9]发现，0.03%核苷酸能够显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中脂肪酶活性。Lin等[18]发现，中药能够提高凡纳滨对虾蛋白质和脂肪的表观消化率、增加对虾体重、提高肠和肝胰腺中蛋白酶活性。王芸等[19]发现，黄芪、大黄和甘草能够显著提高对虾的生长性能。肠道菌群的稳定对于保持肠道正常消化、吸收、维持肠道的屏障功能以及机体的免疫力非常重要[20]。王栋栋等[21]研究发现，在饲料中添加中草药提取物对肠道内的弧菌起一定抑制作用。于明超[22]研究芽孢杆菌与中草药综合作用对凡纳滨对虾肠道菌群的影响，发现一定浓度的中草药制剂可以影响凡纳滨对虾的肠道菌群类型。4结论本试验发现，使用复方诱食剂饲喂凡纳滨对虾可以明显提高对虾的增重率、特定生长率和成活率，降低饲料系数，能够提高对虾肝胰腺、胃肠道的消化酶活力和改善肠道菌群的组成，提高肠道菌群的多样性水平。关于该诱食剂对于凡纳滨对虾影响的更深层次机理，有待进一步研究。