在动物生产中长期使用抗生素类药物容易产生负面影响，如产生耐药性、药物残留、食品安全等问题[1]，因此我国提出在饲料端禁止使用抗生素[2]。微生态制剂具有增强动物自身免疫力、改善饲料转化率、维持动物健康快速生长等生物学功能[3-4]。纳豆芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌的一个亚种，属于好氧菌中的非致病革兰氏阳性菌[5]。纳豆芽孢杆菌具有耐酸耐碱的特性，可在酸性胃环境中保持良好的稳定性，进入肠道后产生的代谢物能够抑制有害菌生长，调节肠道菌群微生态平衡，保障肠道正常功能运转[6]。肉仔鸡日粮中添加纳豆芽孢杆菌可以显著提高免疫器官指数，增强肉鸡免疫反应[7]。发酵纳豆芽孢杆菌能够有效降低肉鸡的料重比，提高肠道中乳酸杆菌的含量[8]。乳酸菌和芽孢杆菌联用，可在不同程度上提高肉仔鸡的饲料利用率，促进肉仔鸡生长，提高法氏囊指数，增强机体免疫功能[9]。目前，有关纳豆芽孢杆菌的研究多集中于对肉鸡生长性能及免疫作用的影响，关于其对肠道菌群影响的研究甚少。因此，本试验在肉仔鸡日粮中添加纳豆芽孢杆菌，观察其对肉仔鸡生长性能、免疫功能及肠道菌群的影响，以期为纳豆芽孢杆菌在肉仔鸡的生产应用中提供参考。1材料与方法1.1试验设计选取180只1日龄科宝肉仔鸡随机分为2组，每组6个重复，每个重复15只鸡，对照组肉鸡饲喂基础日粮，试验组在基础日粮＋300 mg/kg纳豆芽孢杆菌。试验期42 d。试验地点在河南大用实业有限公司，试验鸡由公司提供。试验所用纳豆芽孢杆菌购自日本株式会社目黑研究所，为灰棕色至黄棕色粉末。纳豆芽孢杆菌含量≥1.0×1011 CFU/g，推荐量为300 mg/kg。基础日粮参照《鸡饲养标准》（NY/T 33—2004）进行配制，基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）项目1~21日龄22~42日龄原料组成/%玉米58.6161.31豆粕33.4830.49豆油3.604.49石粉1.321.34磷酸氢钙1.751.40食盐0.290.30赖氨酸0.240.14蛋氨酸0.270.13氯化胆碱0.200.17预混料0.240.23合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.3512.89粗蛋白质/%20.7619.44钙/%1.080.98有效磷/%0.640.58蛋氨酸/%0.470.44注：1.每千克日粮预混料为日粮提供：VA 8 000 IU、VB1 4.2 mg、VB2 4 mg、VB6 4.5 mg、VB12 0.02 mg、VD3 3 000 IU、VE 20 IU、VK3 2 mg、生物素0.15 mg、叶酸1.0 mg、D-泛酸11 mg、烟酸10 mg、抗氧化剂100 mg、I 0.40 mg、Cu 10 mg、Zn 75 mg、Fe 80 mg、Mn 80 mg、Se 0.30 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.2饲养管理采用三层笼养，肉仔鸡自由采食与饮水，环境温度随着日龄增加逐渐降低，每周下降2~3 ℃，从1日龄的32 ℃降到23 ℃并保持不变。按照鸡场免疫程序进行接种。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验期间每周对试验鸡进行空腹称重并详细记录耗料量，计算试验肉鸡的平均日采食量、平均日增重和料重比。平均日采食量=(喂料量-余料量)/(试验天数×鸡数)(1)平均日增重=(末重-初重)/试验天数(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.3.2血清免疫指标在肉仔鸡21、42日龄，从每个重复选取1只鸡翅静脉采血，无抗凝血3 500 r/min离心10 min，收集血清分装于2 mL离心管中，-20 ℃冷冻保存。血清用于测定免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）的含量，采用南京建成生物工程研究所试剂盒采用方法为酶联免疫吸附法（ELISA）测定。1.3.3空肠炎症因子试验肉仔鸡采血后屠宰，取出肠道，纵向剪开空肠，用生理盐水冲洗掉肠道内容物，收集黏膜于冻存管中-80 ℃保存待测。称取空肠黏膜，按重量体积比1 g∶9 mL的比例加入9倍体积的PBS（pH值7.4），使用匀浆器充分匀浆。2 000~3 000 r/min离心20 min，收集上清，-20 ℃冷冻，白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）采用南京建成生物工程研究所试剂盒使用酶联免疫吸附法（ELISA）测定。1.3.4肠道菌群收集盲肠内容物于无菌冻存管中，置于液氮中保存，用于微生物测定。根据DNeasy® PowerSoil® Pro Kit （QIAGEN）说明书对盲肠内容物微生物群落进行总DNA抽提，使用NanoDrop 2000检测DNA浓度并进行PCR扩增，对回收纯化后的产物构建文库并测序[10]。PCR扩增体系（20 μL）：5×TransStart FastPfu 缓冲液4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、上游引物（5 μmol/L）0.8 μL、下游引物（5 μmol/L）0.8 μL、TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL、模板DNA 10 ng。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 26.0软件进行T检验，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。采用FASTP（version 0.20.0）软件用于盲肠微生物原始测序序列的质控，Flash（version 1.2.7）软件拼接。根据97%的相似度对优化序列进行OTU聚类，消除嵌合体，并统计不同水平下各样品菌群结构的组成。2结果与分析2.1纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响（见表3）由表3可知，1~21日龄，与对照组相比，试验组肉仔鸡平均采食量、平均日增重、料重比差异均不显著（P0.05）。22~42日龄，试验组肉鸡的平均日增重显著高于对照组（P0.05）。1~42日龄，试验组肉鸡的平均日增重显著高于对照组（P0.05），肉鸡42日龄体重显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.T002表3纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响项目对照组试验组SEMP值初重/g50.7848.500.090.08321日龄体重/g773.63796.190.180.12642日龄体重/g2 296.76b2 407.94a27.310.0211~21日龄平均日采食量/[g/(只·d)]50.8253.191.220.055平均日增重/[g/(只·d)]34.6835.890.690.287料重比1.471.490.040.74422~42日龄平均日采食量/[g/(只·d)]120.92123.601.430.343平均日增重/[g/(只·d)]72.53b76.75a2.410.026料重比1.671.610.050.1891~42日龄平均日采食量/[g/(只·d)]85.8788.400.810.061平均日增重/[g/(只·d)]54.06b56.82a1.280.019料重比1.591.560.030.106注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡血清免疫的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，21日龄和42日龄试验组肉仔鸡血清IgA和IgG含量差异不显著（P0.05），IgM含量分别升高了37.63%、38.85%（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.T003表4纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡血清免疫的影响项目对照组试验组SEMP值21日龄IgA0.410.950.570.39IgM11.32B15.58A0.630.01IgG31.6742.539.880.3042日龄IgA3.223.820.960.55IgM11.35B15.76A0.570.01IgG54.9153.245.140.76g/L2.3纳豆芽孢杆菌对肉仔空肠炎症因子的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，21日龄试验组肉鸡空肠黏膜IL-1β的含量下降21.97%（P0.05），42日龄肉鸡空肠IL-1β的含量极显著下降47.02%（P0.01）。21、42日龄试验组肉鸡空肠黏膜IL-6、TNF-α的含量均有不同程度降低（P0.05），IL-10的含量具有一定程度的提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.T004表5纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡空肠炎症因子的影响项目对照组试验组SEMP值21日龄IL-1β27.3121.314.310.20IL-6102.5194.737.930.35IL-10265.28304.6824.520.14TNF-α64.2056.046.020.2142日龄IL-1β56.81A30.10B8.760.01IL-694.0294.193.510.96IL-10282.04283.1825.470.97TNF-α54.4851.648.820.75g/L2.4纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠微生物区系的影响2.4.1盲肠微生物α多样性分析通过高通量测序分析最终获得3 514 657条有效序列，平均长度416 bp。按照97%相似性对非重复效序列进行OTU聚类分析，得到所有样本平均聚类的OTU数目为648个。对序列进行随机抽样并获得对应的数量构建稀释曲线，见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.F001图1稀释曲线注：CON组为对照组，BN组为试验组；下图同。由图1可知，该曲线趋于平坦，说明测序数据量足够大并且样本的测序数据量合理。纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠菌群多样性的影响见表6。由表6可知，与对照组相比，试验组肉鸡肠道微生物多样性有所提高。对照组和试验组盲肠菌群测序覆盖率达到99.87%，说明样本中未检测序列的概率很低。各组间42日龄肉鸡盲肠生物群落α多样性指数差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.T005表6纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡盲肠菌群多样性的影响项目SobsAceChaoShannonSimpsonCoverage对照组417.33461.40468.143.470.140.999试验组395.50447.66461.893.520.120.999SEM19.540.330.0421.3422.410.000P值0.2900.5340.7860.8840.6710.1672.4.2盲肠微生物Beta多样性分析（见图2）由图2可知，根据样品间距离，微生物群落有部分相似性，群落结构相似度较高，分析表明对照组和处理组差异显著（P0.05），同组微生物具有明显聚类。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.F002图2盲肠微生物Beta多样性分析2.4.3盲肠微生物菌群结构分析（见图3~图5）由图3可知，对照组和试验组肉仔鸡盲肠菌群由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobaceteriota）和变形菌门（Proteobacteria）等菌门组成，是不同组别中菌群的主要组成成分，其中前4种微生物大约占群落总数的98%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.F003图342日龄盲肠菌群门水平相对丰度由图4可知，对照组和试验组肉仔鸡盲肠菌群由另枝菌属（Alistipes）、粪杆菌属（Faecalibacterium）、拟杆菌属（Bacteroides）、未分类f_norank_o_梭菌目_UCG-014（norank_f_norank_o_Clostridia-UCG-014）、未分类_f_毛螺菌属（unclassified_f_Lachnospiraceae）、梭菌目vadin BB60菌科的norank_f_菌属（noramk_f__Clostridiales_vadin BB60_group）、瘤胃菌属（Ruminococcus_torques_group）、Barnesiella、巨单胞菌属（Megamonas）、罗姆布茨菌（Romboutsia）、布劳特氏菌属（Blautia）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）、Shuttleworthia、Colidextribacter、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）等其他菌门组成，是不同组别中菌群的主要组成成分，其中前10种微生物大约占群落总数的74%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.F004图442日龄盲肠菌群属水平相对丰度由图5可知，试验组Enorma、未分类_f_黄杆菌属（norank_f_Flavobacteriaceae）、Paludicola显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.008.F005图5肠道微生物菌群属水平组间差异注：“*”表示P0.05。3讨论3.1纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡生长性能的影响有研究发现，纳豆芽孢杆菌能够降低肉仔鸡腹部脂肪的堆积，显著提高肉鸡日增重和饲料转化效率[11]。本试验结果表明，饲料中添加纳豆芽孢杆菌可显著提高肉仔鸡平均日增重、降低料重比，与上述试验结果一致，说明纳豆芽孢杆菌能够显著提高肉仔鸡的生长性能。3.2纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡血清免疫的影响IgM是抗原刺激后产生的第一种抗体，可以通过杀菌、激活补体等作用提高机体免疫功能[12-13]。据报道，肉仔鸡日粮中添加不同剂量复合益生菌后可显著提高血清IgG和IgM含量[14]。张俊瑜等[15]研究发现，肉鸡日粮中加入不同水平的纳豆芽孢杆菌均能够提高血清IgG、IgM、IgA含量，与胥振国等[16]的研究结论一致。本试验结果显示，日粮中添加纳豆芽孢杆菌提高肉仔鸡血清IgA、IgG、IgM含量，表明纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡的机体免疫有一定的促进作用，可减轻肉仔鸡炎症反应的发生。3.3纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡肠道炎症的影响当病原菌进入肠道后，肠相关淋巴样组织（gut-associated lymphoid tissue，GALT）释放多种细胞因子（如白细胞介素、肿瘤坏死因子、干扰素等物质），可有效避免有害病菌入侵，维持肠道健康[17]。细胞因子参与和介导免疫炎症反应[18]，根据细胞因子的作用可分为参与促进炎症反应的促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-α等）以及具有缓解炎症反应的抗炎因子（IL-10、IL-4等）[19]。当机体发生炎症时，机体内促炎细胞因子IL-6、IL-1β含量升高，导致炎症加剧[20]。赵会利等[21]发现，将纳豆芽孢杆菌与牛奶混合饲喂犊牛可降低断奶犊牛IL-6和IL-1β的含量，缓解犊牛的断奶应激，从而影响犊牛的生长发育。在本试验中，纳豆芽孢杆菌能够降低肉仔鸡肠道黏膜促炎因子IL-1β的含量，从而调节肉仔鸡肠道免疫系统保持稳定。3.4纳豆芽孢杆菌对肉仔鸡肠道菌群的影响肠道是动物机体的重要消化器官，包含大量的微生物。肠道微生物对机体的营养代谢、生长起重要作用，也是导致动物肠道免疫系统成熟的重要因素。因此，肠道微生物菌群的数量与结构影响着动物机体的消化和健康。动物机体受到品种、日粮、所处环境尤其是胃肠道环境的变化时，能够引起肠道微生物的变化，进而对动物机体产生影响，因此，动物机体与其肠道菌群之间存在共生关系[22-23]。肠道菌群α多样性中，Ace指数和Chao1指数反映了菌群的丰富程度，其值越大，菌群丰富度越大；Shannon指数和Simpson指数反映了肠道菌群的多样性，Shannon指数越大，Simpson指数越小，物种多样性越大[24]。随着肠道菌群的多样性增加，肠道微生物群对入侵细菌的抵抗力也进一步增强，两者呈正相关[25]。本试验中，与对照组相比，试验组肉仔鸡盲肠中Shannon指数、Simpson指数均有不同程度的上升和下降趋势，说明添加纳豆芽孢杆菌能丰富肠道菌群多样性。本试验基于PCoA分析发现，纳豆芽孢杆菌改变了菌群结构。肠道菌群结构与动物生长、发育和健康存在密切联系，对动物机体物质代谢、营养吸收、免疫调节和保护屏障等方面具有重要作用[26]。有研究显示，添加芽孢杆菌可调节动物肠道菌群组成及维持肠道健康[27]。黄俊文等[28]研究发现，添加纳豆芽孢杆菌仔猪肠道内容物中乳酸杆菌和双歧杆菌数量上升，肠黏膜中乳酸杆菌数量上升且大肠杆菌数量下降。吴高峰等[29]对小鼠灌胃纳豆芽孢杆菌溶液，结果显示，肠道益生菌群（包括乳酸杆菌、双歧杆菌、拟杆菌等）显著增多，肠道致病菌群（包括肠球菌、肠杆菌、变形杆菌等）均明显减少。吴德华等[30]研究在仔犬日粮中添加纳豆芽孢杆菌也得到了类似结果。钟青萍等[31]研究发现，纳豆芽孢杆菌对一些常见的肠道致病菌也具有明显的抑制作用，如沙门氏菌、大肠杆菌等。陈冬金等[32]研究表明，纳豆菌复合组unclassified_o__Clostridiales的相对丰度显著降低。杨利娜等[33]研究发现，单胃动物盲肠中的微生物多样性最高，其优势菌群主要有拟杆菌门与厚壁菌门。原因可能是纳豆芽孢杆菌分泌抗菌物质，如吡啶二羧酸和多黏菌素抑制致病菌（如痢疾杆菌、原发性大肠杆菌、伤寒菌、沙门氏菌等）的生长，拮抗肠内病原细胞，缓解肠道疾病[5,34-35]。本试验结果显示，在肉仔鸡的肠道微生物中，厚壁菌门相对丰度最高，其次为拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、厚壁菌门，上述均为优势菌群；在属水平以另枝菌属、粪杆菌属、拟杆菌属、未分类f_norank_o_梭菌目_UCG-014为主，对照组Ruminococcaceae_UCG-010显著高于纳豆菌处理组，提高了另枝杆菌的相对丰度，粪杆菌属、拟杆菌属的相对丰度有所降低，改变了肉仔鸡盲肠优势菌群结构的占比，说明饲喂纳豆芽孢杆菌能够有效调节肠道菌群比例，改变肉仔鸡肠道菌群组成，进而提高了肉仔鸡的生长性能。4结论本研究结果表明，纳豆芽孢杆菌可改善肉仔鸡肠道菌群结构，提高肠道菌群丰富度和多样性，增强机体免疫功能，进而提高肉仔鸡生长性能。