紫花苜蓿(Medicago sativa),素有“牧草之王”的美誉,其可消化蛋白质20%左右,类胡萝卜素含量100~550 mg/kg,富含各种维生素、矿物质、皂苷、黄酮多糖及多种未知生长因子[1-2]。紫花苜蓿还含有9种药效氨基酸,含量为60%~62%,高于冬虫夏草[3]和红枣[4]药效氨基酸含量,具有一定的药用价值。紫花苜蓿的必需氨基酸指数(EEAI)接近1,属于优质蛋白[5]。紫花苜蓿多糖具有多种生物学活性,如保护神经[6]、清除自由基[7]、细胞免疫和调节肠道形态[8]。鉴于此,紫花苜蓿被广泛应用于畜牧养殖业,在水产养殖上也得到了广泛应用。何云等[9]研究发现,黄河鲤鱼饵料中添加10%苜蓿草粉能显著提高消化酶活性。团头鲂饵料中添加一定量的紫花苜蓿鲜草,可以提高消化酶活性,改善生长性能,获得较好的经济效益[10]。星斑川鲽幼鱼获得最佳生长时紫花苜蓿浓缩叶蛋白(APC)替代鱼粉蛋白的适宜比例为19.0%;从保护养殖水体的角度出发,APC替代鱼粉蛋白的比例应控制在30%以内[11-12]。宋坚等[13]研究了苜蓿草粉对刺参幼参生长、体成分及免疫酶活性的影响,发现苜蓿草粉的添加比例10%时,刺参的养殖效果最佳。王维新[14]进行了紫花苜蓿替代海藻饲喂海参试验,指出海参饵料中紫花苜蓿可以替代30%海藻。中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)简称河蟹、大闸蟹,是我国重要的养殖蟹类之一,肉味鲜美,深受广大消费者的青睐,由此带动了中华绒螯蟹养殖业的快速发展。但养殖过程中牛奶病、腹水病、甲壳溃疡病、颤抖病等病害频发,致使中华绒螯蟹养殖经济效益明显下降,且中华绒螯蟹新型饵料蛋白源有待开发利用。因此,本试验开展了紫花苜蓿对中华绒螯蟹生长性能、消化酶活性和代谢相关因子基因表达的影响研究,以期拓宽中华绒螯蟹的优质饲料源,推动中华绒螯蟹养殖业绿色健康发展。1材料与方法1.1试验材料中华绒螯蟹购自天津蟹源水产养殖公司,体重(23.46±3.02) g。紫花苜蓿粉购自沧州红日草业有限公司,常规营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.013.T001表1紫花苜蓿的常规营养水平营养水平粗蛋白质粗脂肪粗灰分粗纤维水分含量18.773.649.3228.565.32%试验饵料:本试验配制4种饵料,分别为对照组、5%组(添加5%紫花苜蓿)、10%组(添加10%紫花苜蓿)和15%组(添加15%紫花苜蓿)。各组饲料原料经粉碎、混合、制粒(粒径2.0 mm),烘干后备用。4种饵料组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.013.T002表2试验饵料组成及营养水平项目对照组5%组10%组15%组原料组成鱼粉13.0013.0013.0013.00杂鱼5.005.005.005.00豆粕22.0021.0019.0018.00苜蓿草粉05.0010.0015.00花生粕11.0011.0011.0011.00菜籽粕6.006.006.006.00虾糠7.007.007.007.00麦麸14.0010.007.003.00高筋面粉15.0015.0015.0015.00植物油1.001.001.001.00磷酸二氢钙3.703.703.703.70维生素预混料1.001.001.001.00矿物质预混料1.001.001.001.00胆碱0.300.300.300.30合计100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白质35.4435.3735.6135.53粗脂肪4.023.993.943.96粗纤维7.037.247.317.39粗灰分10.8110.7610.4910.88水分7.837.717.867.75注:1.预混料购自天津凯源饲料有限公司。2.营养水平均为实测值。%主要试剂:TrizolTMReagent试剂购自美国ABI公司;M-MLV Reverse、Oligo DT、Random Primer、D2000 Plus DNA Ladder、Bradford蛋白浓度测定试剂盒等购自北京索莱宝科技有限公司;Bestar®SybrGreen qPCR Mastermix购自DBI®Bioscience。主要仪器:MIKRO 200R高速台式冷冻离心机(德国Hettich科学仪器公司),TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司),RT-6000全自动酶标仪(深圳雷杜生命科学有限公司),T100TM PCR扩增仪、Gel DocTM EZ凝胶成像仪(美国伯乐公司),StepOneTM 荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。1.2饲养管理本试验设置4个试验组,分别为对照组、5%、10%和15%紫花苜蓿组,每组3个重复。中华绒螯蟹饲养容器规格730 mm×490 mm×420 mm,每个容器中投放10只中华绒螯蟹,共计120只,水箱内设置遮蔽物以供中华绒螯蟹隐藏。中华绒螯蟹每日投喂2次(8:00和17:00),每日投喂量为中华绒螯蟹体质量的4%~6%,投喂1 h后将未能吃完的剩余饵料捞出,避免污染水质。根据剩余饵料情况及时调整投喂量,以保证中华绒螯蟹的生长需求。养殖用水为充分曝气自来水,水体盐度2‰。试验期间,每天检测水质指标,溶解氧>6 mg/L,水温为(24±1) ℃,pH值为7.0~7.5,亚硝酸盐含量0.05 mg/L,饲养时间60 d。1.3测定指标及方法1.3.1生长指标分别于试验前后,对各组中华绒螯蟹进行称重和计数,统计采食量。各生长指标计算公式为:存活率=Nt/N0×100%(1)体增重率=(Mt-M0)/M0×100%(2)特定生长率=(lnMt-lnM0)/t×100%(3)饲料系数=饲料摄食量/体增重(4)式中:Nt和N0分别表示初始个数(只)和终末个数(只);Mt和M0分别表示初始体质量和终末体质量(g);t为饲养时间(d)。1.3.2消化酶活性饲养60 d后,对各组中华绒螯蟹进行称重,并于冰上麻醉,无菌解剖取出肝胰腺、胃和肠道,分别称取适量样品,加入9倍体积预冷的生理盐水匀浆(冰浴),8 000 r/min、4 ℃离心10 min,取上清液,采用文献[15]方法略加修改,进行消化酶活性测定。蛋白酶活性以1 mg蛋白的酶液每分钟水解干酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位(U/mg prot)。淀粉酶活性以1 mg蛋白的酶液每分钟使可溶性淀粉分解产生1 μg葡萄糖作为1个酶活力单位(U/mg prot)。脂肪酶活性以1 mg蛋白的酶液每分钟催化脂肪产生1 μmol脂肪酸为1个酶活力单位(U/mg prot)。纤维素酶活性测定:采用文献[16]方法略有修改。在37 ℃下,用含1 mg蛋白的酶液每分钟催化纤维素生成1 μg还原糖作为1个酶活力单位(U/mg prot)。1.3.3代谢相关因子基因表达量中华绒螯蟹肝胰腺组织总RNA提取按照TrizolTM reagent试剂盒说明书进行。引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司,序列见表3。选用β-action(内参)作为参照引物。主要检测蜕皮激素受体基因(EcR)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、淀粉酶(Es-AMY)、甘油三酯脂肪酶(Es-ATGL)、细胞色素c氧化酶(Es-COX)、ATP合酶(Es-ATP synthase)、谷胱甘肽过氧化物酶(Es-GPx)和过氧化氢酶(Es-CAT)因子表达量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.013.T003表3引物序列基因名称引物序列序列号长度/bpβ-action-F5'-AGAAATCGTGCGAGACATCA-3'HM143924.1181β-action-R5'-GAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3'EcR-F5'-GCCACACTTCAACGAGAAGA-3'KU041139.1201EcR-R5'-GCTGTTTCCAAACACAATGC-3'mTOR-F5'-AGAAGCTGCATGACTGGGAC-3'c148249_g1122mTOR-R5'-CGGTCACACGACACACTGTA-3'Chymotrypsin-F5'-CCGAAGGCACCATCAGCA-3'MN964178.1140Chymotrypsin-R5'-AACCCACTCGTTGGAAATCA-3'Es-AMY-F5'-CCCCTCACGACGATAGTTAC-3'KU301756.1218Es-AMY-R5'-GTTGTTGATGGCGACGAA-3'Es-ATGL-F5'-TGGCACTATGACGACACCC-3'MF182405.1228Es-ATGL-R5'-CACGGAGAAGACGCAAGA-3'Es-COX-F5'-TAAGACAACCAGGCAGAC-3'KX870110.1276Es-COX-R5'-CTAAAGGTGGGTAGACAG-3'Es-ATP synthase-F5'-TTACAGCCCTCACATA-3'3355549235Es-ATP synthase-R5'-GCATTAAAGCGAAAG-3'Es-GPx-F5'-AAAGAGCGGTTGTGAGTA-3'MT989434.1134Es-GPx-R5'-GGTAGCGGGTGTATGG-3'Es-CAT-F5'-ATCCCTGTCAACTGCC-3'GU361618.1256Es-CAT-R5'-GCCGCTCTTCCTCAT-3'PCR反应程序按照文献[17]进行。2-△△Ct方法分析基因的相对表达量。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析,LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示,P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1紫花苜蓿对中华绒螯蟹生长性能的影响(见表4)由表4可知,随着饵料中紫花苜蓿含量升高,中华绒螯蟹的存活率、增重率和特定生长率出现先增加后降低的趋势,其中10%苜蓿组中华绒螯蟹的增重率和特定生长率显著高于对照组和5%苜蓿组(P0.05),而10%苜蓿组中华绒螯蟹的饵料系数显著低于其他组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.013.T004表4紫花苜蓿对中华绒螯蟹生长性能的影响组别初始体质量/g终末体质量/g存活率/%增重率/%特定生长率/(%/d)饵料系数对照组23.69±2.7450.21±5.6573.33±11.55111.50±13.05c1.24±0.11b1.68±0.05a5%组24.10±2.8952.03±4.7476.67±5.77112.60±12.43bc1.25±0.10b1.62±0.03ab10%组23.16±3.3456.09±6.2486.67±15.27143.88±11.92a1.48±0.08a1.46±0.04c15%组22.91±3.0652.69±6.3283.33±5.77134.06±10.22ab1.41±0.07ab1.58±0.07b注:同列数据肩标字母不同表示差异显著(P0.05),字母相同或无字母表示差异不显著(P0.05);下表同。2.2紫花苜蓿对中华绒螯蟹消化酶活性的影响(见表5)由表5可知,10%组中华绒螯蟹肝胰腺蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性显著高于对照组(P0.05);与对照组相比,10%组中华绒螯蟹胃中的蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶活性显著升高(P0.05);10%组中华绒螯蟹肠道脂肪酶和纤维素酶活性显著高于对照组(P0.05)。研究表明,中华绒螯蟹饵料中添加10%的紫花苜蓿有助于提高肝胰腺、胃、肠消化酶活性,从而提高饵料的消化吸收率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.013.T005表5紫花苜蓿对中华绒螯蟹消化酶活性的影响组织组别蛋白酶淀粉酶脂肪酶纤维素酶肝胰腺对照组25.536±1.594b0.949±0.046b0.501±0.068b1.143±0.2325%组30.232±5.417ab1.402±0.023a0.642±0.087a1.157±0.04310%组37.442±3.359a1.415±0.147a0.736±0.081a1.575±0.12315%组31.041±2.324ab1.394±0.127a0.665±0.034a1.195±0.205胃对照组0.259±0.021c0.483±0.0380.073±0.006c2.357±0.224b5%组0.665±0.064b0.510±0.0510.088±0.008b3.030±0.358a10%组0.901±0.074a0.783±0.0150.178±0.010a3.287±0.268a15%组0.715±0.053b0.628±0.0680.165±0.003a2.535±0.278b肠对照组0.461±0.0390.264±0.0090.030±0.003b1.683±0.178c5%组0.477±0.0390.270±0.0030.041±0.003a2.068±0.455bc10%组0.497±0.0420.276±0.0300.047±0.004a2.897±0.498a15%组0.467±0.0540.274±0.0580.042±0.006a2.530±0.344abU/mg prot2.3紫花苜蓿对中华绒螯蟹相关因子基因表达的影响(见表6)由表6可知,饵料中添加苜蓿,中华绒螯蟹肝胰腺组织中代谢和抗氧化相关因子基因的表达水平均明显上调。10%组中华绒螯蟹肝胰腺中的EcR、mTOR、Es-ATGL、Chymotrypsin、Es-GPx和Es-CAT基因表达显著高于其他组(P0.05),10%组中华绒螯蟹中的Es-AMY、Es-COX和Es-ATP synthase基因表达显著高于对照组(P0.05)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.013.T006表6紫花苜蓿对中华绒螯蟹相关因子基因表达的影响组别EcRmTORChymotrypsinEs-AMYEs-ATGLEs-COXEs-ATP synthaseEs-GPxEs-CAT对照组1.013±0.190b1.030±0.314c1.015±0.212c1.022±0.257b1.007±0.147c1.012±0.193b1.007±0.148b1.044±0.385c1.017±0.216c5%组1.207±0.246b3.607±0.306b2.823±0.596b1.301±0.217b2.097±0.250b1.815±0.377a2.059±0.359a3.979±0.536b2.334±0.517b10%组1.649±0.292a6.139±0.822a4.198±0.680a1.832±0.310a2.967±0.440a2.202±0.439a2.385±0.320a7.457±1.232a3.606±0.710a15%组1.073±0.177b5.780±0.224a3.021±0.563b1.169±0.186b1.658±0.386b1.900±0.224a1.009±0.059b3.661±0.806b1.141±0.234c3讨论3.1紫花苜蓿对中华绒螯蟹生长性能的影响紫花苜蓿营养价值高,蛋白质、可消化粗纤维、矿物质和维生素含量丰富;包括动物生长需要的必需氨基酸以及一些稀有氨基酸,如瓜氨酸、刀豆氨酸等;钙、镁、钾等元素含量很高,且不含磷脂酸,有利于动物消化利用[18]。添加50 g/kg紫花苜蓿喂养的鲤鱼,平均日增重、相对生长率、增重率、饵料系数均优于对照组[19]。宋坚等[13]发现,在刺参饵料中添加10%的紫花苜蓿草粉可以有效提升特定生长率,降低饲料系数。赵华林等[20]研究了苜蓿草粉作为草鱼饵料的适宜添加量,发现2.5%和5.0%苜蓿草粉饵料组较对照组的生长性能与饲料效益明显提高。本研究发现,10%紫花苜蓿草能够显著提高中华绒螯蟹的增重率和特定生长率,显著降低饲料系数,表明紫花苜蓿对于中华绒螯蟹具有较好的促生长作用。3.2紫花苜蓿对中华绒螯蟹消化酶活性的影响消化酶是生物体内一类催化各种生化反应的特殊蛋白质,对生物体从外界摄取的食物进行消化和分解。消化酶活性的提高,有利于促进动物对营养物质的消化吸收,进而促进其生长[21]。何云等[9]研究发现,鲤鱼饵料中添加10%的苜蓿草粉能够显著提高蛋白酶和淀粉酶的活性。张春梅等[22]发现,饵料中添加80 g/kg的紫花苜蓿,能够有效提高禾花鲤肝胰腺及肠道中的蛋白酶和淀粉酶活性。本研究中,饵料中添加5%、10%和15%的紫花苜蓿,中华绒螯蟹肝胰腺、胃和肠道中的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶活性均有一定程度的提高,以添加10%紫花苜蓿组中华绒螯蟹的消化酶活性最高。究其原因,可能是紫花苜蓿中的未知活性因子,能够促进中华绒螯蟹消化酶的分泌。3.3紫花苜蓿对中华绒螯蟹肝胰腺相关因子基因表达的影响内分泌系统和神经系统共同调节中华绒螯蟹的蜕壳和生长,其中蜕皮激素(EH)在甲壳动物中的作用需要配体EcR和雌蟹肝胰腺维甲类X受体基因(RXR)两个核受体超家族成员构成转录因子作为媒介;当ECR和RXR形成二聚体,EH才能结合在EcR上,形成的复合体与靶标基因启动子的蜕皮应答元件结合,蜕皮激素进入配体结合袋后,与共阻遏子分离和共激活子结合并相互作用,启动靶标基因的转录,完成整个蜕壳过程[23]。本研究中,10%紫花苜蓿饲料喂养的中华绒螯蟹肝胰腺EcR基因表达显著高于对照组,表明中华绒螯蟹生长过程可能受到紫花苜蓿活性成分的影响,从而上调蜕皮激素受体因子,进而促进中华绒螯蟹的蜕壳和生长。肝胰腺是中华绒螯蟹消化、吸收、代谢和解毒的重要场所,是合成蛋白质的主要器官。蛋白质合成主要的限速步骤是翻译的启动,该过程受到mTOR信号通路的调节[24]。王馨悦[25]研究表明,饵料中添加高比例南极磷虾粉,中华绒螯蟹肝胰腺中mTOR基因表达显著高于对照组,表明中华绒螯蟹肝胰腺蛋白质合成代谢更加活跃。本研究中,紫花苜蓿能够促进中华绒螯蟹肝胰腺mTOR基因表达上调,可能是苜蓿对中华绒螯蟹生长过程中的蛋白质合成起到一定的促进作用。苜蓿中含有多种活性功能成分,苜蓿皂苷可以调节脂质代谢、提高生长性能;苜蓿多糖能够促进生长发育、改善机体代谢;苜蓿黄酮可以起到类激素样作用[18]。本研究发现,紫花苜蓿能够明显上调中华绒螯蟹肝胰腺Chymotrypsin、Es-AMY和Es-ATGL基因表达,该结果与上述显著提高中华绒螯蟹消化酶活性相一致。Zhao等[26]研究发现,生长快速的三疣梭子蟹肝胰腺中与线粒体能量代谢相关的COX、ATP synthase基因表达显著上调。在本研究中,饵料中添加紫花苜蓿的中华绒螯蟹肝胰腺中Es-COX、Es-ATP synthase基因表达均显著高于对照组,表明苜蓿可能通过上调Es-COX、Es-ATP synthase的基因表达,增加了能量代谢,促进了中华绒螯蟹的生长。贾垂攀等[27]研究发现,干扰罗氏沼虾COX2基因的mRNA表达,会使细胞色素C氧化酶的活性降低,导致能量代谢功能降低,显著抑制罗氏沼虾的生长。苜蓿皂苷可以提高抗氧化能力、抗菌消炎,苜蓿黄酮能够提升机体免疫能力;苜蓿多糖可以提高机体细胞免疫和体液免疫功能、提高机体抗氧化能力[18]。本研究发现,紫花苜蓿能够明显上调中华绒螯蟹肝胰腺Es-CAT和Es-GPx基因表达。CAT是重要的抗氧化酶,酶活力与机体清除自由基的能力正相关;GPx有助于将过氧化物转化为毒性较低的羟基化合物,可有效防止活性氧的积累,维持细胞内氧化还原的稳态[28]。本研究中Es-CAT和Es-GPx基因表达上调,可能是由于苜蓿草粉中的活性成分对中华绒螯蟹的抗氧化能力起到了一定的促进作用。4结论紫花苜蓿通过提高中华绒螯蟹蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶活性,上调中华绒螯蟹蜕皮激素受体、糜蛋白酶、雷帕霉素靶蛋白、淀粉酶、甘油三酯脂肪酶、细胞色素c氧化酶、ATP合酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的基因表达,提高中华绒螯蟹生长性能及抗氧化能力。中华绒螯蟹饵料中添加10%紫花苜蓿较为适宜。

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