核桃（Juglans regia L.）又名胡桃、羌桃，胡桃科胡桃属落叶乔木植物，是一种传统的经济树种[1-2]。核桃果实营养价值丰富[3-4]。核桃青皮是核桃果实采摘后的副产品，往往作为垃圾被扔掉，造成资源浪费及环境污染。研究表明，核桃青皮含有丰富的氨基酸、黄酮、多糖、挥发油、生物碱等活性成分[5-7]，具有抗氧化、降血糖血脂、抑菌活性等药理功效[8-10]。因核桃青皮总黄酮具有多种生物学活性[11-12]，将核桃青皮作为功能型饲料，具有广阔的应用前景。马菁菁等[13]研究发现，在鸡饲粮中添加核桃青皮黄酮粗提物可有效提升肉鸡生产性能及抗氧化功能。吴莹等[14]研究发现，在基础日粮中添加核桃青皮黄酮类化合物可以提高动物的免疫力。本试验以核桃青皮为研究对象，采用超声波辅助法提取核桃青皮中总黄酮含量，考察4个单因素对核桃青皮总黄酮得率的影响，应用Box-Behnken响应面设计法优化其最优提取工艺条件，为核桃青皮总黄酮提取工业化生产及其资源开发提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂核桃青皮由广西农业科学院经济作物研究所提供。芦丁标准品购自上海同田生物技术股份有限公司，二苯基苦基肼自由基购自广州皓安生物科技有限公司，维生素C（VC）购自北京华迈科生物技术有限责任公司，硝酸铝（分析纯）购自沈阳从科化工有限公司，氢氧化钠（分析纯）购自济南荣正化工有限公司，乙酸钾（分析纯）购自山东旭祥化工有限公司，无水乙醇（分析纯）购自西安天茂化工有限公司，水为《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682—2008）规定一级水。1.2仪器设备UV759CRT紫外分光光度计购自青岛聚创华业分析仪器有限公司，ESJ208-S沈阳龙腾电子分析天平购自沈阳龙腾电子有限公司，DFY-200A汗诺摇摆式粉碎机购自上海达洛科学仪器有限公司，JM-16D-80超声清洗机购自广东洁盟超声实业有限公司，TQR5-S台式冷冻离心机购自湖南长沙市鸿运仪器公司，60目标准试验筛购自上海过望化工有限公司，TWS-12电热恒温水浴锅购自上海劳达贸易有限公司，B1140得利特超纯水机购自北京得利特科技有限公司。1.3测定指标及方法1.3.1核桃青皮总黄酮提取工艺流程核桃鲜果→果皮分离得到核桃青皮→将核桃青皮晾干→粉碎→80目筛网过筛→将核桃青皮粉末脱脂→称取脱脂样品进行超声辅助提取→离心→浓缩上清液→黄酮粗提液。1.3.2芦丁标准曲线的绘制将烘干至恒重的芦丁标准品用70%乙醇超声辅助溶解，采用亚硝酸钠-硝酸铝法[15-16]绘制标准曲线。准确称取芦丁标准品0.050 g（精确至0.001 g）于1 000 mL棕色容量瓶中，使用70%的乙醇定容至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.05 g/L的芦丁标准中间储备液。使用移液枪分别吸取芦丁标准中间液0.20、0.40、0.80、1.60、3.20、5.00 mL置于6支10 mL棕色容量瓶中，依次加入6% NaNO2溶液2 mL，旋涡振荡摇匀，静置10 min；加入12% Al(NO)3溶液1 mL，旋涡振荡摇匀，静置15 min；加入4% NaOH溶液2 mL，充分摇匀，静置6 min；以70%乙醇溶液定容至刻度，得到质量浓度分别为0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.025 g/L的标准曲线工作液。以空白试剂作对照，在510 nm处测定溶液的吸光度，以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程Y=0.8761X+0.1545，R2=0.999 8。1.3.3核桃青皮总黄酮的提取及含量的测定将自然晾干的核桃青皮粉碎，过80目筛，取适量样品粉末，使用石油醚回流脱脂处理；准确称取已脱脂处理的核桃青皮粉末样品1.000 g（精确至0.001 g）于50 mL具塞离心管中，在超声辅助提取仪中按照液料比20 mL/g加入70%乙醇溶液作为提取溶剂，60 ℃提取40 min，提取完毕后于8 000 r/min离心20 min，将上清液移至250 mL棕色容量瓶中。残渣以相同条件提取2次，合并提取液，使用70%乙醇溶液定容至刻度，即得核桃青皮总黄酮粗提液。准确吸取1 mL核桃青皮总黄酮粗提液于10 mL棕色容量瓶中，按照标准曲线工作液的条件显色，在相同波长下测定吸光度，将吸光度值代入芦丁标准曲线计算黄酮含量。X=c×V×Dm×1 000×100% (1)式中：X为核桃青皮总黄酮含量（%）；c为标准曲线计算得到待测试样液总黄酮的数值（g/L）；V为提取液体积（mL）；D为稀释倍数；m为试样的质量（g）。1.3.4单因素试验分别考察乙醇浓度、液料比、浸提温度、浸提时间等4个单因素对核桃青皮总黄酮提取得率的影响。核桃青皮总黄酮提取的单因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.T001表1核桃青皮总黄酮提取的因素水平设计因素固定因素水平考察因素水平乙醇浓度料液比20 mL/g、浸提温度60 ℃、浸提时间30 min40%、50%、60%、70%、80%液料比乙醇浓度70%、浸提温度60 ℃、浸提时间30 min10、15、20、25、30 mL/g浸提温度乙醇浓度70%、液料比20 mL/g、浸提时间30 min40、50、60、70、80 ℃浸提时间乙醇浓度70%、液料比20 mL/g、浸提温度60 ℃10、20、30、40、50 min1.3.5响应面试验设计根据单因素试验结果，设置4个因素为自变量，核桃青皮总黄酮提取得率为因变量，为优化核桃青皮总黄酮提取工艺参数，采用Box-Behnken软件设计4因素3水平响应面试验，响应面试验因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.T002表2响应面试验因素水平设计水平A乙醇浓度/%B液料比/(mL/g)C浸提温度/℃D浸提时间/min-1602050300702560401803070501.3.6核桃青皮总黄酮体外抗氧化活性试验1.3.6.1DPPH自由基清除率参考文献[17]至文献[18]，准确称取二苯基苦基肼（DPPH）10 mg于100 mL棕色容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，超声辅助溶解，配成100 mg/L DPPH储备液于2~4 ℃环境中储存。用无水乙醇将核桃青皮总黄酮提取液分别稀释为0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L的样品溶液。精确吸取2.0 mL样品溶液于6支10 mL棕色容量瓶中，分别加入2 mL的100 mg/L DPPH储备液，定容摇匀，置于黑暗处静置30 min于510 nm处测定吸光度A1；取相同体积核桃青皮总黄酮提取液，以无水乙醇代替DPPH储备液，按照上述方法处理后在510 nm处测定吸光度A2；以2.0 mL无水乙醇代替核桃青皮总黄酮提取液，加入2 mL 100 mg/L DPPH储备液，按照上述方法处理后在510 nm处测定其吸光度A0；以VC为阳性对照，精密称取一定量的VC标准品配制成相应浓度，操作方法同样品组。计算核桃青皮总黄酮提取液对DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率=1- A1-A2A0×100% (2)1.3.6.2羟自由基清除率参考文献[19]至文献[20]，取6支10 mL棕色容量瓶，分别加入0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L核桃青皮总黄酮提取液各2.0 mL。依次加入6 mmol/L FeSO4溶液2.0 mL、8 mmol/L水杨酸溶液2.0 mL、8.8 mmol/L H2O2溶液2.0 mL，充分摇匀，置于37 ℃水浴锅中反应30 min，以蒸馏水调零，将样品反应液于510 nm处测定吸光度A1；取相同体积核桃青皮总黄酮提取液，以蒸馏水代替H2O2，按照上述方法处理后在510 nm处测定吸光度A2；以蒸馏水代替核桃青皮总黄酮提取液，其他条件不变，在510 nm处测定其吸光度A0；以VC为阳性对照，精密称取一定量的VC标准品配制成相应质量浓度，操作方法同样品组。计算核桃青皮总黄酮提取液对羟自由基清除率。羟自由基清除率=1- A1-A2A0×100% (3)1.4数据统计与分析采用Design-Expert 10.0进行响应面设计和分析，每组试验重复3次，以平均值表示。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇浓度对核桃青皮总黄酮提取得率的影响（见图1）由图1可知，总黄酮提取得率随着乙醇浓度的增加呈先增加后降低趋势。当乙醇浓度为70%时，核桃青皮总黄酮提取得率达到最大值4.81%。原因可能是乙醇浓度较低时，水分含量相对较高使样品中总黄酮未能完全溶解，从而导致总黄酮提取得率较低[21]；当乙醇浓度过高则极性降低，样品中脂溶性和醇溶性物质溶出，使黄酮提取得率有所降低。因此选择乙醇浓度为70%为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F001图1乙醇浓度对核桃青皮总黄酮得率的影响2.1.2液料比对核桃青皮总黄酮提取得率的影响（见图2）由图2可知，随着液料比逐渐增大，核桃青皮总黄酮的提取得率随着溶剂增多而逐渐增大，当液料比达到20 mL/g，核桃青皮总黄酮的提取得率增速趋于平缓。原因是逐渐增加提取溶剂的体积有利于扩大样品与提取溶剂的接触面积，更有利于样品中总黄酮溶出，故液料比低于20 mL/g时，核桃青皮总黄酮的提取得率随着液料比的增加而急剧增加；但液料比高于20 mL/g时，样品中总黄酮已基本完全溶出，故样品中总黄酮提取得率增长缓慢。因此，从经济以及节约资源角度考虑，选择液料比为20 mL/g为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F002图2液料比对核桃青皮总黄酮得率的影响2.1.3浸提温度对核桃青皮总黄酮提取得率的影响（见图3）由图3可知，随着浸提温度的逐渐增加总黄酮得率呈先增大后降低的趋势；当浸提温度为60 ℃时，总黄酮提取得率达到最大值4.97%；继续增加浸提温度黄酮提取得率反而降低。原因是在一定浸提温度范围内升温会导致黄酮类化合物分子扩散速率加快，从而有利于增大其溶解度，故在一定范围内随着浸提温度的升高总黄酮提取得率也呈上升趋势[22]；但当浸提温度达到一定时，继续增加浸提温度，黄酮类化合物会在高温下被破坏，使提取得率有所降低。因此浸提温度选择60 ℃为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F003图3浸提温度对核桃青皮总黄酮得率的影响2.1.4浸提时间对核桃青皮总黄酮提取得率的影响（见图4）由图4可知，随着浸提时间的延长核桃青皮总黄酮得率呈先增加后降低趋势。当提取时间为40 min时总黄酮提取得率达到最大值4.79%。原因可能是延长超声波的作用，可以使植物细胞结构破坏率增加，使更多的总黄酮从核桃青皮中溶出，故总黄酮得率增加。当浸提时间大于40 min时，继续延长浸提时间，总黄酮得率呈下降趋势。原因可能是样品长时间处于超声波作用下，超声辅助提取仪产生的机械作用和空化效应会对总黄酮结构造成一定程度的破坏，从而导致总黄酮得率下降[23]。因此选择浸提时间为40 min为宜。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F004图4浸提时间对核桃青皮总黄酮得率的影响2.2响应面优化及方差分析结果2.2.1响应面试验结果（见表3）利用Design-Expert 10.0软件对表3数据进行方差和模型的显著性分析，得到回归模型方程为：Y=5.41+0.011A+0.063 0B+0.19C+0.21D-0.002 5AB-0.025 0AC+0.037AD-0.11BC+0.053BD+0.082CD-0.31A2-0.14B2-0.26C2-0.28D2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.T003表3响应面试验结果编号ABCD总黄酮提取得率/%1-10014.792100-15.37301014.554-1-1005.10500004.9961-1004.7570-1014.91801-105.21911004.99100-1-104.711100005.091210-104.711300-1-14.70140-10-15.021500115.3116-11004.721710015.3818-100-15.431900005.072010105.4121-10105.132200004.8823-10-104.752401105.44250-1104.642600-114.8427010-15.0128001-15.452900005.38回归模型的方差分析结果见表4。由表4的回归分析结果可知，模型的F值为44.14（P0.000 1），失拟项为3.30（P0.05），表明模型拟合度较好[24-26]。模型的校正决定系数RAdj2=0.971 2，表明该模型可以解释黄酮得率的变化有97.12%来自乙醇浓度、液料比、浸提温度和浸提时间。因此用该模型能较好地预测和分析核桃青皮总黄酮的提取工艺。由F值可知，4个单因素对黄酮得率影响排序为浸提时间（D）＞浸提温度（C）＞液料比（B）乙醇浓度（A）。响应面分析可知，CD具有显著影响（P0.05），B、C、D、BC、A2、B2、C2、D2具有极显著影响(P0.01)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.T004表4回归模型的方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型2.17140.1644.140.000 1**A1.40×10-311.40×10-30.400.537 1B0.0510.0513.320.002 6**C0.4410.44124.220.000 1**D0.5510.55156.450.000 1**AB2.50×10-512.50×10-57.10×10-30.934 0AC1.60×10-311.60×10-30.450.511 1AD1.80×10-411.80×10-40.360.656 8BC0.0510.0513.760.002 3**BD1.00×10-211.00×10-22.840.114 0CD0.0310.037.740.014 7*A20.6110.61174.240.000 1**B20.1210.1234.820.000 1**C20.3010.3085.160.000 1**D20.5110.51144.460.000 1**残差0.05143.50×10-3失拟值0.04104.30×10-33.300.130 4纯误差5.30×10-341.30×10-3总差2.2228注：1.“**”表示影响极显著（P0.01）；“*”表示影响显著（P0.05）。2.RAdj2=0.971 2。2.2.2因素交互作用对核桃青皮总黄酮得率的影响（见图5）相应面越陡峭、等高线图呈椭圆形表明两交互作用对黄酮提取得率影响越显著[27-29]。由图5可知，交互项BC和CD的响应曲面坡度较为陡峭，且等高线呈椭圆，表明液料比与浸提温度、浸提温度与浸提时间对核桃青皮总黄酮得率影响达到显著水平或极显著水平，与表4方差分析结果一致。图5各因素交互作用对核桃青皮总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F5a1（a）乙醇浓度与液料比对总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F5a2（b）乙醇浓度与浸提温度对总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F5a3（c）乙醇浓度与浸提时间对总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F5a4（d）液料比与浸提温度对总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F5a5（e）液料比与浸提时间对总黄酮得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F5a6（f）浸提温度与浸提时间对总黄酮得率的影响2.2.3回归模型最优试验组合验证通过响应面软件得到核桃青皮总黄酮提取得率模型预测的最优参数工艺为乙醇浓度68.87%、液料比19.7 mL/g、浸提温度62.5 ℃、浸提时间38.89 min，模型预测核桃青皮总黄酮提取得率为6.02%。为方便试验操作，确定最终工艺参数条件为乙醇浓度70%、液料比20 mL/g、浸提温度60 ℃、浸提时间40 min，实际测得核桃青皮总黄酮提取得率为6.13%，与预测值相近，说明回归模型对核桃青皮总黄酮提取得率预测结果准确可靠。2.3抗氧化活性结果分析2.3.1核桃青皮总黄酮对DPPH自由基的清除能力（见图6）由图6可知，核桃青皮总黄酮与VC对DPPH自由基的清除能力随着质量浓度的增加呈上升趋势，核桃青皮黄酮对DPPH自由基的清除能力相对VC整体稍低。当核桃青皮总黄酮浓度为1.0 g/L时，对DPPH自由基的清除率为94.98%，与等质量浓度的VC对DPPH自由基的清除能力相近。因此，核桃青皮总黄酮对DPPH自由基具有较强的清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F006图6核桃青皮总黄酮对DPPH自由基的清除能力2.3.2核桃青皮总黄酮对羟自由基清除能力（见图7）由图7可知，核桃青皮总黄酮对羟自由基清除率随着质量浓度的增加上升趋势。当核桃青皮总黄酮浓度为1.0 g/L时，对羟自由基的清除率为89.89%，略低于同浓度下的VC对羟自由基的清除能力。因此，核桃青皮总黄酮对羟自由基具有一定的清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.09.020.F007图7核桃青皮总黄酮对羟自由基的清除能力3结论本研究表明，核桃青皮总黄酮的最佳提取工艺参数为乙醇浓度70%、液料比20 mL/g、浸提温度60 ℃、浸提时间40 min，实际测得核桃青皮总黄酮提取得率6.13%，与预测值相近，说明回归模型准确可靠。体外抗氧化活性研究表明，质量浓度为1.0 g/L的核桃青皮总黄酮提取液对DPPH自由基和羟自由基清除率分别为94.98%、89.89%，略低于同质量浓度的VC的抗氧化能力，但仍表现出较好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂应用。