甘蔗为禾本科甘蔗属，是主要生长于热带、亚热带的多年生实心植物[1]。甘蔗渣是甘蔗经压榨提汁后的残渣，含有40%~50%纤维素、20%~35%半纤维素、10%~30%木质素、2%~4%粗蛋白[2-3]以及一定量的水分和糖分，可应用于饲料开发。Suryaningrum等[4]研究发现，利用枯草芽孢杆菌粗酶提取物对甘蔗渣进行酶解处理可显著提高甘蔗渣中蛋白质、溶解蛋白、还原糖含量，降低灰分、粗纤维和木质素含量，有望将其开发作为鱼饵料原料。吕仁龙等[5]在不同比例的甘蔗渣中添加糖蜜研究其对发酵型全混合型日粮（FTMR）品质和干物质消化率的影响，结果表明，添加糖蜜可提升FTMR的发酵品质和干物质消化率。低共熔溶剂（seep eutectic solvents，DES）是一种由氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）组成的复合溶剂体系[6]。与其他绿色溶剂相比，DES具有安全无毒、成本低、生物可降解、提取效率高、蒸气压低等特点，已应用于植物活性成分提取[7-10]。本研究以天然有机碱（氯化胆碱）为HBA，有机酸（草酸、乳酸）和胺类（尿素）为HBD，制备不同的DES溶剂，筛选出最优的DES组合；以最优DES组合结合超声波法提取甘蔗渣中的纤维素，以纤维素含量为指标，探究液料比、含水量和超声时间对甘蔗渣纤维素含量的影响，并采用响应面法对提取工艺进行优化，得到最优提取参数，以期为纤维素的高效制备及其在不同领域的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂甘蔗渣（广西来宾湘桂糖业有限责任公司），氯化胆碱（上海麦克林生化科技有限公司），尿素、草酸（天津市大茂化学试剂厂），乳酸（AR）、硫酸（AR）、氢氧化钠（AR）、30%过氧化氢（西陇科学股份有限公司），硫酸镁（天津博迪化工有限公司），蒽酮（天津市科密欧化学试剂有限公司），乙二胺四乙酸（EDTA，天津奥普升化有限公司）。1.2仪器与设备JA12002型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），KQ-300DB型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司），GZX-GF101-3 BS型电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司），DF-101S型集热式磁力加热搅拌器（金坛市医疗仪器厂），JH1108型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）。1.3试验方法1.3.1甘蔗渣预处理甘蔗渣剪切，洗净，60 ℃下烘至恒重，粉碎，过80目筛，密封保存。1.3.2DES溶剂的制备不同种类DES对纤维素提取效果不同，为筛选出最佳的DES，以氯化胆碱为氢键受体与不同种类的氢键供体（草酸、尿素、乳酸）按照一定物质的量的比（1∶1、1∶2）混匀，80 ℃搅拌至澄清均一的液体，即得到DES溶剂[11]。不同类型的DES溶剂组成见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.T001表1不同类型的DES溶剂组成项目HBAHBD物质的量的比DSE-1氯化胆碱草酸1∶1DSE-2氯化胆碱草酸1∶2DSE-3氯化胆碱尿素1∶1DSE-4氯化胆碱尿素1∶2DSE-5氯化胆碱乳酸1∶1DSE-6氯化胆碱乳酸1∶21.3.3甘蔗渣纤维素的提取准确称取2.000 g甘蔗渣粉末，按照不同液料比加入不同含水量的DES，在一定温度下超声处理一定时间，以蒸馏水漂洗，漂洗结束得到水润状态下的纤维素粗产品。参考张宁等[11-12]的方法，稍加修改。将9.0 g氢氧化钠、0.3 g硫酸镁、0.3 g EDTA、300 mL 30%过氧化氢溶液混匀后加入纤维素粗产品，并于100 ℃下搅拌1 h，直至完全脱色至白色。用盐酸中和直至中性，真空抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤至中性，用无水乙醇洗涤，于60 ℃下烘干即得甘蔗渣纤维素。1.3.4纤维素含量的测定1.3.4.1标准曲线参考王伟[13]的方法，稍加修改。准确称取0.1 g纯纤维素，装入100 mL的容量瓶后置于冰水浴，加入70 mL 60%硫酸，冰水浴处理30 min，并用60%硫酸补至刻度线，摇匀。吸取此液10.0 mL装入100 mL容量瓶，冰浴并加蒸馏水至刻度线，即得0.1 g/L纤维素标准溶液。分别准确量取0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL的0.1 g/L纤维素标准溶液于比色管中，并用蒸馏水滴加至2.00 mL，向每支比色管中加入0.50 mL 2%蒽酮试剂、5.00 mL 80%硫酸，混匀，于沸水浴中加热10 min。取出冷却至室温后用分光光度计在620 nm波长下测其吸光度值。根据测试结果绘制标准曲线，得到回归方程为：y=0.004x-0.237 2，R2=0.997 8。1.3.4.2纤维素含量的测定称取甘蔗渣纤维素样品0.1 g于100 mL容量瓶中，加入70 mL 60%硫酸，并于冰水浴下消化处理30 min，使用同浓度的硫酸滴加至刻度线，摇匀，过滤。取2.5 mL滤液于25 mL容量瓶中，并补加蒸馏水至刻度线，摇匀。吸取2.00 mL滤液于试管中，加入0.50 mL 2%蒽酮试剂、5.00 mL 80%硫酸，充分摇匀，在沸水浴中加热10 min，取出冷却至室温，于620 nm波长测其吸光度值，将结果代入纤维素标准曲线方程，求出甘蔗渣纤维素含量，计算样品纤维素含量。X=A×10-6×CB×100%(1)式中：A为根据标准曲线方程得出的纤维素含量（μg）；B为样品质量（g）；C为稀释倍数，取500倍；X为样品中甘蔗渣纤维素含量（%）。1.3.5DES溶剂的筛选精确称取1.000 g甘蔗渣粉末，分别加入30 mL不同类型的DES溶剂，在液料比30 mL/g、温度70 ℃、超声50 min条件下，按1.3.3节方法分别提取甘蔗渣纤维素，根据式（1）计算含量，筛选出最优的DES。1.3.6单因素试验根据1.3.3节方法提取纤维素，以纤维素含量为指标，探究液料比（20、25、30、35 mL/g）、含水量（40%、50%、60%、70%、80%）、超声时间（20、30、40、50、60 min）3个因素对纤维素含量的影响。1.3.7响应面优化试验设计基于单因素试验，根据Box-Behnken设计原理，以液料比（A）、含水量（B）、超声时间（C）为自变量，以纤维素含量作为响应值，设计响应面优化试验，响应面试验因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.T002表2响应面试验因素水平设计水平A液料比/(mL/g)B含水量/%C超声时间/min-1255040030605013570601.4数据统计与分析使用Origin 2018软件绘图；响应面结果分析采用Design-Expert 8.0.6软件进行处理。2结果与分析2.1DES的筛选结果不同类型DES提取的甘蔗渣纤维素含量结果见图1。由图1可知，与其他DES溶剂相比，由氯化胆碱-尿素（1∶2）组成的DES-4的提取效果最佳，提取的甘蔗渣纤维素的含量为73.53%。本研究中不同组成和物质的量的比的DES提取的甘蔗渣纤维素含量不同的原因可能与DES和纤维素之间的多重相互作用（离子/电荷-电荷以及氢键的相互作用）有关[14]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.F001图1不同种类DES提取的甘蔗渣纤维素含量2.2单因素试验结果2.2.1液料比对纤维素含量的影响（见图2）由图2可知，随着DES液料比增加，样品的纤维素含量先升高后下降。当溶剂量过低时，溶剂不能有效浸渍甘蔗渣，半纤维素和木质素脱除较少，纤维素含量较低[12]；当液料比为30 mL/g时，纤维素含量达到最大值为81.90%，当继续增加溶剂的用量，纤维素含量反而减少，这可能是因为溶剂过多导致体系中氢键被破坏，从而造成目标化合物的含量降低[15]。因此，选择甘蔗渣与DES的液料比为30 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.F002图2液料比对纤维素含量的影响2.2.2含水量对纤维素含量的影响（见图3）由图3可知，随着含水量不断增加，纤维素含量不断增大；当含水量达到60%时，纤维素含量为81.90%，达到最大值；继续增加含水量，纤维素含量反而呈逐渐降低趋势。这可能是因为含水量过低，DES黏度较大，抑制溶质的分子扩散，因而纤维素含量较低[16]。当含水量达到60%后，继续增加含水量，纤维素含量反而逐渐降低，这可能是因为DES分子间作用力被水分子破坏，DES与纤维素间氢键作用力减弱，从而使甘蔗渣纤维素含量下降[17]。因此，选择含水量为60%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.F003图3含水量对纤维素含量的影响2.2.3超声时间对纤维素含量的影响（见图4）超声波可产生强烈的空化、扰动效应，破坏植物细胞壁的组织结构[18]，使样品纤维素含量不断溶出。由图4可知，当超声时间增加到50 min时，样品中纤维素含量达到最大值，为84.07%。之后随着超声波处理时间的继续延长，纤维素含量下降，原因可能是纤维素分子间氢键作用力减小，其他非纤维素成分水解，使纤维素含量呈下降状态[19-20]。因此，选择超声时间为50 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.F004图4超声时间对纤维素含量的影响2.3响应面试验结果与方差分析结果2.3.1响应面结果响应面试验结果见表3，采用Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行回归拟合分析，方差分析见表4，得到二次多元回归方程为：Y=83.75+0.62A+0.061B+1.45C-0.048AB-0.25AC-0.36BC-1.72A2-1.66B2-1.58C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.T003表3响应面试验结果编号A/(mL/g)B/%C/min纤维素含量/%135604079.35230605084.98330706081.78430704079.81530605084.02625604078.44725606082.05830605083.35930605082.661035606081.941130506081.921225705079.211325505079.441430605083.751530504078.531635705081.211735505081.6310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型59.31096.5909.4900.003 6A3.11013.1104.4800.072 0B0.03010.0300.04300.841 2C16.700116.7024.0600.001 7AB0.00910.0090.0130.912 4AC0.26010.2600.3700.559 8BC0.50010.5000.7300.422 3A212.460112.49017.9900.003 8B211.560111.56016.6600.004 7C210.570110.57015.2300.005 9剩余4.86070.690失拟项1.93030.6400.8700.524 7误差项2.93040.730总变异64.17016注：1.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.R2=0.924 3，RAdj2=0.826 9，F0.05（2,14）=3.74，F0.01（2,14）=6.51。由表3和表4可知，失拟项P=0.524 70.05为不显著，说明模型构建成功，试验外的因素对本试验纤维素的含量影响不大。通过判定系数（R2）可评价回归模型的拟合程度，由方差分析知R2=0.924 3，其值接近1，表明该回归方程的拟合度较好[21]。由表4可知，模型中的C、A2、B2、C2对响应面影响极显著（P0.01），A、B、AB、AC、BC对响应面的影响不显著（P0.05）。F值越大，对响应值的影响越大。各因素对纤维素含量的影响顺序为超声时间液料比含水量。2.3.2各因素交互作用对纤维素含量的影响（见图5~图7）由等高线形状可直观地看出各因素间相互作用的大小。若响应面的曲线走势较陡，即两个因素间交互显著时，等高线呈椭圆形，反之，若响应面曲线走势平缓，说明两个因素间的交互作用影响较小，呈圆形[22]。由图5~图7可知，图7响应面斜率更陡峭，表明含水量和超声时间的交互作用对纤维素含量的影响较大，图5的响应面的梯度较小，等高线为圆形，表明液料比和含水量的交互作用对纤维素含量影响较小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.F005图5液料比和含水量对纤维素含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.F006图6液料比和超声时间对纤维素含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.019.F007图7含水量和超声时间对纤维素含量的影响2.3.3优化与验证试验根据回归模型，得出甘蔗渣纤维素含量最高的优化组合为含水量59.68%、液料比30.74 mL/g、超声时间54.48 min，甘蔗渣含量的理论最高值为84.12%。考虑到实际操作的可行性，将含水量调整为60%、液料比31 mL/g、超声时间55 min，在此条件下进行验证试验，得到甘蔗渣含量为84.28%。该值和理论值极为接近，表明采用响应面分析法优化甘蔗渣纤维素的提取工艺可行。与王艳萍等[23]甘蔗渣纤维素含量为80.25%提取效果相比，本试验得到的纤维素含量更高，表明与碱液相比DES作为提取溶剂更能够有效提取甘蔗渣纤维素。3结论本试验探索了超声辅助DES法对甘蔗渣纤维素的提取效果，发现氯化胆碱-尿素（1∶2）对甘蔗渣纤维素的提取效果最优；超声辅助DES溶剂提取纤维素的最佳工艺条件为含水量60%、液料比31 mL/g、超声时间55 min，此条件下甘蔗渣纤维素的含量可达到84.28%。