N-乙酰谷氨酸（NAG）能够通过激活尿素循环调节动物氮代谢，影响氨基甲酰磷酸合酶生成，促进内源性精氨酸（Arg）的合成[1-2]。N-氨甲酰谷氨酸（NCG）作为NAG类似物，两者结构、作用相似，但NCG更稳定，不会被酰基分解酶水解，影响内源性Arg合成[3-4]。Arg作为一种多功能半必需氨基酸或条件必需氨基酸，能够积极调控哺乳动物的生理代谢，提高动物的生长性能、免疫力[5]，改善奶牛的泌乳性能、繁殖性能[6]。Arg是合成蛋白质的基本物质，还是核苷酸、一氧化氮（NO）、多胺和谷氨酰胺等的前体产物。多胺是蛋白质生成与分化中的重要生命元素，其中腐胺、精胺和亚精胺等在调节DNA、RNA和蛋白质合成及生物膜稳定性方面具有重要作用，而且可在胎儿时期促使大量细胞生成[7]。Arg的代谢物鸟氨酸经脱羧酶作用转化为腐胺，随后参与精胺和亚精胺的产生过程[8]。NO可作用于血管，增强血管生成与舒张，增加妊娠后期胎盘血流量[9]。雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路可被NO激活，促进翻译开始以及细胞形成蛋白质[10]。Arg在瘤胃中会被大量降解，并且与部分碱性氨基酸产生阻抑作用，在日粮中添加时必须包被，成本较高，所以在反刍动物中未普遍使用。NCG的半衰期长、降解率低，不会与体内组氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸产生交互影响两者的作用，可高效调控机体内Arg代谢[8,11-13]。有研究发现，日粮中添加NCG可提高仔猪血清Arg含量[14-15]，明显提高猪背最长肌和腓肠肌蛋白生成速度[15-17]。近年来，关于NCG的研究多集中在仔猪生长性能和家禽生产性能方面[18-22]，在奶牛生产中的研究较少。本试验基于转录组学研究奶牛日粮中添加NCG对其机体代谢的影响，初步探讨NCG的作用机制，为NCG在奶牛生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验设计选取体况、胎次、泌乳天数、产奶量相近的泌乳中期荷斯坦奶牛240头，随机分为2组，每组10个重复，每个重复12头奶牛。对照组（NCG组）为基础日粮，试验组（NCG0组）为基础日粮+20 g/(头·d) NCG。试验期60 d，其中预试期15 d，正式试验期45 d。NCG（纯度97％）购自亚太兴牧（北京）科技有限公司。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米22.22泌乳净能/(MJ/kg)7.07豆粕8.09粗蛋白/%15.00棉籽粕3.68中性洗涤纤维/%32.00DDGS2.87淀粉/%25.60预混料2.75钙/%0.95小苏打0.82磷/%0.50氧化酶0.27酵母0.21玉米青贮32.27苜蓿干草14.82燕麦草1.86全棉籽3.67甜菜粕3.70糖蜜2.77注：1.每千克预混料为日粮提供：VA 220 kIU、VD 22 kIU、VE 2 200 mg、I 70 mg、Se 20 mg、Co 45 mg、Cu 710 mg、Zn 4 100 mg、Mn 2 300 mg。2.营养水平中泌乳净能为计算值，参考文献[23]计算，其余均为实测值。1.2饲养管理试验于2021年7月至9月在宁夏某牛场进行。试验奶牛散栏式饲养，饲喂全混合日粮（TMR）3 次/d，自由饮水，挤奶3 次/d。1.3测定指标及方法1.3.1样品采集试验第30 d，每组分别选择8头奶牛，尾静脉采血10 mL于EDTA抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液于冻存管中，-80 ℃保存，用于转录组的检测。1.3.2生物信息学分析1.3.2.1cDNA文库构建及测序采用Trizol法提取所有样品的总RNA。文库构建后，对样品进行质检，检测文库总浓度及文库有效浓度。样品经过RNA抽提、纯化、建库后，采用第二代测序技术，对这些文库进行双末端测序。1.3.2.2差异表达基因的筛选、功能注释和富集分析试验通过了DESeq对基因组表现的差异性研究，筛选表达差异倍数大于1，显著性P值小于0.05的基因。使用topGO进行GO富集分析，找出与全基因组背景相比，差异基因显著富集的GO term，结合KEGG代谢通路富集分析，确定差异基因行使的主要生物学功能。1.4数据统计与分析数据均采用Excel 2019进行初步整理，SAS 9.4进行统计分析，t检验进行差异显著性分析，Duncan's法进行多重比较，以|log２（差异倍数）|1且Ｐ0.05为标准，使用DEGSeq1.12和DeSeq 1.10.1软件对NCG0组和NCG组进行差异表达基因筛选和分析，采用GO-Seq1.10、topGO 2.10软件对差异表达基因集进行GO功能富集分析，KOBASv 2.0.12软件筛选KEGG数据库中差异表达基因富集到的信号通路，使用CAZy数据库的对应工具Hmmscan将基因集与CAZｙ数据库进行比对。以P0.05作为差异显著性的阈值。2结果与分析2.1测序质量控制与对比分析（见表2、表3）由表2可知，将NCG组和NCG0组进行测序，分别得到原始序列数45 536 902、44 195 422条，通过质量控制，得到NCG组和NCG0组的有效序列为41 765 047、40 669 062条。各组的Q20均在97%以上，Q30均在92%以上。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.T002表2测序数据质量项目NCG组NCG0组原始序列45 536 90244 195 422有效序列41 765 04740 669 062有效碱基数6 264 757 1636 100 359 375N/%0.002 00.001 9Q20/%97.2097.28Q30/%92.9393.10由表3可知，各组的测序数据与参考基因组的比对效率均在94%以上。研究表明，本试验中的各组荷斯坦奶牛血液转录组测序结果准确可靠，可用于后续试验分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.T003表3测序数据与参考基因组的比对组别总映射多重映射特定映射NCG组39 413 508（94.37%）1 319 355（3.35%）38 094 152（96.65%）NCG0组38 412 603（94.45%）1 271 974（3.31%）37 140 628（96.69%）2.2差异基因表达分析（见图1、表4）由图1、表4可知，将NCG组和NCG0组样品的转录数据进行对比分析，结果共筛选出102个差异基因，56个上调表达基因和46个下调表达基因；聚类结果显示，NCG组的8个样本聚为一类，NCG0组的8个样本聚为一类，表明同一组的生物学重复表达模式相近且这些基因可能具有共同的功能注释或处于同一条代谢途径及信号通路中。主要差异表达基因包括FGFR2、SLC7A4、SPESP1、ZP2等。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.F001图1差异表达基因的火山和聚类分析结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.T004表4转录组主要差异表达基因基因log2FCP值少突胶质细胞转录因子2（OLIG2）2.730.000 140蛋白聚糖（ACAN）1.770.006 300钩微管栓系蛋白1（HOOK1）1.210.007 400成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）2.710.008 200精子黏附分子1（SPAM1）1.490.008 400溶质载体家族7成员4（SLC7A4）1.620.012 000精子赤道段蛋白1（SPESP1）1.690.016 000透明带糖蛋白2（ZP2）1.330.042 000溶质载体家族6成员13（SLC6A13）-3.720.048 000纤维蛋白1（FBLN1）-2.860.012 000漩涡生精转座子（MAEL）-2.860.020 000细胞周期蛋白N末端结构域1（CNTD1）-2.750.022 000阿斯塔辛类金属内肽酶（ASTL）-2.640.000 081雌激素受体2（ESR2）-2.220.048 000胶原蛋白Ⅰ型α1链（COL1A1）-2.140.025 0002.3差异表达基因GO富集分析或功能注释对差异表达基因进行GO富集分析，按照细胞组分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和生物过程（biological process，BP）进行GO分类。从每个GO分类中挑选富集最显著的前10个GO条目，见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.F002图2差异表达基因GO富集分析结果显示，差异表达基因共富集2 106条，其中显著富集331条，显著富集的差异表达基因中，41条位于CC，61条位于MF，229条位于BP。2.4差异表达基因KEGG富集分析（见图3）由图3可知，对差异表达基因进行KEGG通路分析，发现差异表达基因共富集于81条代谢通路，显著富集10条通路，富集于前15位的代谢通路，包括PI3K-Akt信号通路、氮素代谢、催乳素信号通路、mTOR信号通路等。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.F003图3差异表达基因KEGG富集分析2.5日粮添加NCG对奶牛生产性能及乳品质的影响（见表5）由表5可知，NCG组奶牛的乳脂率、乳蛋白率、产奶量比NCG0组分别提高1.99%、0.60%、3.33%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.005.T005表5日粮添加NCG对母牛泌乳性能及乳品质的影响分析项目乳脂率/%乳蛋白率/%产奶量/[kg/(头·d)]P值0.490.670.26NCG0组3.51±0.583.34±0.1636.34±8.45NCG组3.58±0.633.36±0.2237.55±6.913讨论3.1日粮添加NCG对奶牛差异表达基因的影响本试验对两组奶牛血浆进行了转录组差异基因分析发现，FGFR2、SLC7A4、SPESP1、ZP2等基因显著上调。FGFR2可参与细胞外信号通路，调节源于中胚层和外胚层的细胞增殖分化等多种生理学过程。邓惜缘等[24]研究发现，FGFR2在奶牛乳腺组织中相对表达量较高。FGFR2基因上调可能与奶牛产奶相关性状有联系，但本试验差异基因中未发现有与乳脂率、乳蛋白率、产奶量相关的基因，需后续试验进行深入研究。有研究报道，SLC7A4是氨基酸转运体基因，在猪的胎盘中表达量较高，可调节子宫腔的氨基酸含量，进而影响母体的内分泌功能[25]。SLC7A4通过运输氨基酸参与精氨酸传递，增加NO含量[26]，促进妊娠后期血流量增加[9]。伍治敏等[27]研究表明，SLC7A4可能是影响胎儿生长发育、妊娠后期重要氨基酸来源的关键调控因子。SPESP1是哺乳动物参与精卵结合的可溶性蛋白质蛋白[28]。研究显示，颗粒细胞中表达的ZP2 mRNA也随卵泡生长增加[29]。因此，随着卵泡生长，可增加颗粒细胞数量以及表达产生的透明带蛋白[30]，表明SLC7A4、SPESP1、ZP2等基因的表达水平可能与繁殖性能相关。3.2日粮添加NCG对奶牛差异表达基因GO功能富集的影响本试验差异基因GO富集发现，与繁殖相关GO条目在BP分类中被显著富集，如受精的调节、预防多精受精、受精的负调节、多生物过程调节等。精氨酸通过刺激母体发育，使营养从母体向胚胎以及胎儿传递，提高胎儿存活率[8]。孙玲伟[31]研究发现，对妊娠期湖羊进行营养限饲NCG可促进胎儿生长发育。日粮中补充NCG可促进胎盘形成、发育和生长[32-33]。本研究结果表明，日粮中添加NCG可促进奶牛胚胎形成和发育，改善繁殖性能。3.3日粮添加NCG对奶牛差异表达基因KEGG功能富集的影响精氨酸对乳腺上皮细胞生长具有良好的促进作用[34-35]。本试验中差异基因KEGG富集涉及通路包括PI3K-Akt信号通路、氮素代谢等。PIP3可作为第二信使，由PI3K催化PIP2羟基磷酸化生成。本试验中，FGFR2基因显著上调，可激活PIP3招募AKT蛋白至质膜上，活化部分AKT。被活化的AKT将进一步激活下游调控通路中的mTOR，解除其对真核起始因子4E（eIF4E）的抑制作用，促进蛋白质的合成[36-37]。陈丽丽等[38]指出，泌乳中期的奶牛日粮中添加NCG可间接影响奶牛产奶量，显著提高乳蛋白率。Chacher[39]研究表明，日粮中添加NCG的奶牛组可改变乳成分含量，显著增加乳蛋白产量。本试验结果表明，日粮中添加NCG可能通过激活PI3K-Akt信号通路促进蛋白质合成。NCG能够提高营养物质的消化率，使机体在高含量精氨酸的状态下，双水解生成鸟氨酸和氨，刺激动物机体内氨的代谢、促进尿素循环，增强肾脏截留氮的能力，促进氨基酸稳定[40]，从而使更多的氨基酸可用于合成和代谢，减少尿素氮排出[41]。敬盈嘉[42]研究表明，日粮中添加NCG可显著降低奶牛乳尿素氮含量，随着NCG添加量增加，牛奶的乳蛋白率也呈升高趋势。杨金山[43]研究表明，日粮中添加不同剂量NCG可显著降低荷斯坦公牛粪氮含量和尿氮含量，显著提高氮沉积和氮的利用率。本试验中，氮素代谢通路在KEGG富集中被显著富集，表明日粮中添加NCG可能通过对氮素代谢通路进行调控，影响尿素循环，降低尿素氮排出量，提高氮沉积量，为机体沉积蛋白质提供物质。3.4日粮添加NCG对奶牛生产性能及乳品质的影响奶牛生产性能可受多种因素调控，如奶牛品种、日粮、年龄、泌乳时期、个体、饲养管理等[44]。氨基酸是奶牛需要的基本化合物，NCG是精氨酸增效剂，可提高体内精氨酸浓度[43]。Chacher等[45]研究表明，在奶牛泌乳高峰期时添加NCG能够提高乳脂率、乳蛋白率。顾凤飞[44]在泌乳中期奶牛补饲NCG，两组奶牛的采食量和产奶量差异不显著，乳蛋白含量具有升高的趋势，与本试验研究结果相近，表明奶牛日粮中添加NCG能够改善乳品质。围产期奶牛生理状态不稳定，所需营养物质剧增，此时添加NCG效果更佳。与围产期相比，泌乳早期奶牛生理状态已趋于稳定，添加NCG可优先用于维护健康，缓解因产奶量过高引起的乳房炎症问题。泌乳中期生理状态稳定，从日粮中获得足够的营养，所以添加NCG对这一阶段产生的影响并不显著。4结论本研究发现，日粮中添加20 g/(头·d) NCG可显著上调与奶牛生产性能、繁殖性能相关的基因，如FGFR2、SLC7A4、SPESP1、ZP2等。差异基因GO富集表明，在生物过程的差异表达基因显著富集，如受精的调节、预防多精受精、多生物过程调节、卵激活、多生物生殖过程与繁殖性能相关，表明NCG可能促进奶牛胚胎形成、子宫发育，改善繁殖性能。差异基因KEGG富集表明，氮素代谢通路、PI3K-Akt信号通路等显著富集，表明NCG可能通过影响尿素循环和激活PI3K-Akt信号通路，降低尿素氮排出量，提高氮沉积量，促进蛋白质合成。