反刍动物瘤胃中含有大量细菌、真菌和原虫等多种厌氧微生物，这些微生物通过分解饲粮中的纤维素、蛋白质等营养物质，为宿主提供生长代谢的能量来源[1]。细菌在瘤胃中占比较大，是公认的纤维降解优势菌。与细菌相比，瘤胃真菌数量仅占瘤胃总微生物的8%左右，且生长速度相对滞后，但在降解大片段植物纤维过程中起到重要作用，是高效的木质化纤维素降解菌[2-3]。饲粮是影响反刍动物瘤胃微生物群落结构组成的重要因素之一，健康稳定的瘤胃微生物区系与家畜的生理健康状况相关[4-5]。牦牛是青藏高原特有的反刍家畜，可以很好地适应高寒、缺氧、营养匮乏等极端环境，是青藏高原牧民的重要生活和经济来源[6-7]。青藏高原牦牛主要沿用终年放牧的粗放式管理模式，但饲草的季节性匮乏严重影响牦牛生产性能的发挥[8-9]。粗蛋白作为饲粮中重要的营养物质之一，其水平对家畜的生长发育和机体健康至关重要。但目前有关牦牛饲粮中蛋白水平营养调控的研究仅限生理生化及瘤胃细菌等方面[10-11]，对瘤胃真菌菌群组成及功能等方面的研究相对匮乏。本试验在探讨饲粮蛋白水平对牦牛生长性能的基础上，利用高通量测序技术对牦牛瘤胃真菌菌群多样性和结构组成进行探究，以此增加对牦牛瘤胃微生物区系的了解，并为牦牛健康养殖及相关营养学研究提供参考。1材料与方法1.1试验设计及饲养管理选取健康、平均体重为（107.54±4.72）kg的2岁母牦牛24头，耳标标记，随机分为4组，每组6个重复，每个重复1头牛。配制4种代谢能相近而蛋白（CP）水平不同的饲粮，L组、ML组、MH组、H组饲粮的蛋白质含量分别为9.64%、11.25%、12.48%、13.87%。试验饲粮组成及营养水平见表1。预试期15 d，正式试验期135 d，饲养期间每天牦牛饲喂2次（8：00、17：00），自由饮水。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.003.T001表1试验饲粮组成及营养水平（干物质基础）项目L组ML组MH组H组原料组成/%燕麦草40.040.040.040.0玉米30.329.428.224.6小麦21.618.615.615.6菜籽粕5.13.61.80.6棉粕0.32.44.87.8豆粕0.33.67.29.0食盐0.60.60.60.6预混料0.60.60.60.6磷酸氢钙0.60.60.60.6碳酸钙0.60.60.60.6合计100.0100.0100.0100.0营养水平干物质/%82.5083.0085.0083.50粗蛋白质/%9.6411.2512.4813.87中性洗涤纤维/%38.2336.7034.0333.14酸性洗涤纤维/%21.8119.3118.1018.07钙/%0.670.690.710.73磷/%0.520.540.540.59代谢能/(MJ/kg)12.0412.0111.9811.95注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 20 000 IU、VD3 15 000 IU、VE 1 250 IU、Cu 375 mg、Fe 1 500 mg、Zn 750 mg、Mn 1 000 mg、Se 7.5 mg。2.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.2测定指标及方法1.2.1样品采集饲养试验结束时，使用瘤胃插管法采集瘤胃液样品，将采集的样品经4层纱布过滤，置于2 mL冻存管中，投入液氮，于-80 ℃冰箱中保存。1.2.2生长性能在正式试验期的第1 d和第135 d晨饲前，对牦牛进行称重，计算平均日增重。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(1)1.2.3瘤胃真菌高通量测序采用CTAB法对瘤胃液样品进行基因组DNA提取，分别使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000检测DNA的纯度和浓度。以基因组DNA为模板，对真菌的ITS1区域进行扩增，引物为F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGA-AGTAA-3'）和R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。对目的片段回收并进行文库构建，NovaSeq 6000测序平台上机测序。测序数据去除引物和Barcode得到原始序列，经过严格的过滤处理，得到高质量数据，与物种注释数据库进行比对并去除嵌合体，得到有效数据。基于非聚类去噪法进行ASV鉴定，比对生成最终的ASV特征表并对序列进行物种注释。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel 2016软件进行整理，R软件（v3.6.1）进行进行单因素方差分析，Tukey多重比较法检验组间显著性。结果以平均值和标准误（SEM）表示，P0.05表示差异显著。微生物分析时使用R软件计算瘤胃真菌的Alpha多样性（Ace指数、Shannon指数），Beta多样性使用基于Bray-Curtis距离的限制性主坐标分析CPCoA，分别计算优势菌群在门、属水平的相对丰度值，并进行组间显著性差异分析。2结果与分析2.1饲粮蛋白水平对牦牛生长性能的影响（见表2）由表2可知，MH组和H组牦牛的末重和平均日增重均显著高于L组和ML组（P0.05），且以MH组最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.003.T002表2饲粮蛋白质水平对牦牛生长性能的影响项目初重/(kg/头)末重/(kg/头)平均日增重/[kg/(头·d)]L组108.50178.83b0.52cML组106.33189.83b0.62bMH组107.50211.17a0.77aH组107.83206.50a0.73aSEM0.963.130.02P值0.9000.0010.001注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。2.2瘤胃真菌高通量测序结果基于Illumina NovaSeq测序平台对24个牦牛瘤胃液样品进行ITS高通量测序，共得到原始序列2 109 754条，经过筛选、质控、剔除低质量序列，共获得1 750 060条高质量序列，平均每个样品72 919条序列。基于非聚类去噪法共获得1 101个扩增子序列变体（ASV）。稀释曲线随测序深度的增加逐渐趋于平缓，表明测序深度趋于饱和，测序所得数据量已经覆盖样本中的绝大多数物种，满足后续微生物多样性分析条件。2.3饲粮蛋白水平对牦牛瘤胃真菌菌群多样性的影响（见表3、图1）由表3可知，L组、ML组、MH组牦牛瘤胃真菌菌群的Ace指数变化较小，H组牦牛瘤胃真菌菌群的Ace指数显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.003.T003表3牦牛瘤胃真菌菌群Alpha多样性项目L组ML组MH组H组SEMP值Ace指数435.42b509.45b544.68b760.68a29.860.010Shannon指数3.834.664.954.950.170.060注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5与此同。由图1可知，L组和ML组样品在坐标轴上聚集，而MH组与H组样品单独聚类且与各组分离，CPCoA分析可以解析试验样本19.5%的变异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.003.F001图2牦牛瘤胃真菌菌群Beta多样性2.4饲粮蛋白水平对牦牛瘤胃真菌菌群组成的影响（见表4、表5）通过序列比对和注释，牦牛瘤胃真菌共注释到11个门、39个纲、91个目、184个科、335个属和314个种。由表4可知，在门水平上，新美鞭菌门、担子菌门和子囊菌门为牦牛瘤胃真菌中相对丰度排名前三的优势菌群，其余菌门相对丰度均较小，H组牦牛瘤胃子囊菌门的相对丰度显著高于L组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.003.T004表4饲粮蛋白水平对牦牛瘤胃真菌优势菌门相对丰度的影响项目新美鞭菌门担子菌门子囊菌门被孢菌门球囊菌门L组47.0023.411.71b0.000 30.005 4ML组39.6019.423.71ab0.017 90.003 7MH组41.6030.334.04ab0.001 70.005 4H组34.809.346.78a0.018 20.010 5SEM0.040.030.010.000.00P值0.7800.1500.0100.2200.540注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。%由表5可知，在属水平上，牦牛瘤胃真菌优势菌属为维希尼克氏酵母属、枝梗鞭毛菌属和盲肠鞭菌属等；H组牦牛瘤胃麦角菌属的相对丰度显著低于ML组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.003.T005表5饲粮蛋白水平对牦牛瘤胃真菌优势菌属相对丰度的影响项目L组ML组MH组H组SEMP值维希尼克氏酵母属21.9517.9627.494.140.030.050枝梗鞭毛菌属10.9615.6513.257.330.020.540盲肠鞭菌属10.514.091.130.280.020.160根囊鞭菌属1.092.112.687.710.010.340新美鞭菌属1.531.562.533.060.010.770梨囊鞭菌属1.390.670.450.890.000.490Buwchfawromyces2.320.220.540.230.000.350麦角菌属0.31ab1.36a0.86ab0.20b0.000.030%3讨论3.1饲粮蛋白水平对牦牛生长性能的影响蛋白质作为生命活动的物质基础，参与机体的多种重要生理功能。饲粮蛋白不足会导致反刍动物机体消化功能紊乱、幼畜生长发育受阻及生产性能下降等；而蛋白过剩又会加重肝肾负担，引起瘤胃酸中毒等症状[12]。补充适量蛋白可通过改善饲粮接受度、加强有机物发酵和调节胃排空间接刺激反刍家畜的能量摄入，促进生长性能提高和能量效率利用[13]。孙鹏飞等[14]发现，精料蛋白水平为14.56%时可提高暖季牦牛的生长性能，有效发挥牦牛的繁殖潜能。Peng等[15]发现，精料蛋白水平为19%时，早期断奶牦牛的生长性能最优。本研究中，适当提高牦牛饲粮蛋白水平有助于提高牦牛生长性能，且以MH组（12.48%）牦牛的生长性能最优。季节、年龄等条件均会影响牦牛的最适饲粮蛋白水平，可能是受胃肠道发育状况及营养代谢速率差异的影响。3.2饲粮蛋白质平对牦牛瘤胃真菌菌群多样性和组成的影响随着高通量测序技术和分子生物学发展，反刍动物瘤胃细菌多样性、群落组成及生理功能的研究增多，但关于瘤胃真菌的相关研究较少[16-17]。瘤胃真菌能够深入植物纤维组织内部，降低内部张力，疏松纤维组织，使其他微生物更易利用，对帮助机体消化吸收植物纤维类物质具有重要意义[18]。瘤胃细菌和真菌也存在直接的底物竞争关系，所以瘤胃微生物并非独立生存，而是相互影响，共同构成稳定的瘤胃内环境[19-20]。研究发现，荷斯坦奶牛瘤胃真菌群落结构随日粮精粗比例调整发生变化[21-22]。韦玥瑞[23]发现，内蒙古绒山羊补饲含蛋白的精料可显著提高瘤胃真菌的丰富度。本研究中，饲喂高蛋白饲粮同样可显著提高牦牛瘤胃真菌的丰富度，对多样性并不会产生显著影响。研究表明，饲喂纤维含量较高的饲粮时，动物瘤胃中厌氧真菌的数量较高[24]。但也有研究指出，适当的精料有利于厌氧真菌孢子萌发[25]，也可解释本研究中真菌多样性趋势的变化。反刍动物瘤胃真菌主要通过产生纤维素降解酶降解植物中的果胶等物质[26]。子囊菌门和新美鞭菌门是牛瘤胃中的优势菌门[3]，与本研究结果一致。子囊菌门主要负责木质素和角蛋白等有机物质的降解[27]；新美鞭菌门能够穿透难降解的纤维组织甚至维管组织使植物纤维组织疏松，从而被其他微生物降解，还可协同分解纤维素、半纤维素和果胶等物质[28-29]。本研究中，高蛋白组瘤胃子囊菌门的相对丰度显著高于低蛋白组，表明增加发酵底物的蛋白水平有助于子囊菌门的繁殖。本试验中，维希尼克氏酵母属、枝梗鞭毛菌属和盲肠鞭菌属是牦牛瘤胃主要的优势菌属。荷斯坦奶牛瘤胃真菌中丰度较高的菌属为柄孢壳属、曲霉属和德巴利酵母属等，与本试验结果有所差异，主要因为不同瘤胃发酵底物会刺激不同的真菌定植生长，造成优势菌群种类和相对丰度的差异。付子琳等[30]发现，放牧组和舍饲组滩羊的瘤胃真菌优势菌属在数量上也存在差异。因此，反刍动物瘤胃真菌群落的相对组成在门水平上相对稳定，但在属水平上波动较大，随动物种属和采食饲粮的不同波动较大。4结论本试验结果表明，蛋白水平为12.48%的饲粮更有助于提高牦牛生长性能，可改善牦牛瘤胃真菌菌群的丰富度，调节瘤胃微生物区系。