玉米作为主要的粮食作物以及重要的饲料原料，在不同生长发育阶段，收割玉米茎秆和果穗进行切碎加工并贮藏发酵，可以制得青贮玉米饲料[1-3]。青贮玉米具有产量高、营养丰富的特点，是重要的饲料来源[4-7]。为了减缓饲料作物的病虫害，在玉米、大豆等主要饲料原料的农作物生产中使用农药，会对饲料的生产安全造成隐患。施用的农药不能完全消除，会随着制成的饲料进入动物体内，会在一定程度上对肉、蛋、奶的品质造成影响，进而影响人类的健康[8]。因此，检测青贮玉米饲料中的农药残留十分必要[9]。目前，国内现有饲料中农药残留检测相关标准《饲料中有机磷农药残留量的测定 气相色谱法》（GB/T 18969—2003）仅限于有机磷类农药残留的测定。饲料样品提取液经Envi-18柱、Envi-Carb柱、Sep-PakNH2柱净化后上机分析，该方法样品前处理时间长，提取液经3种不同净化柱净化时操作烦琐，且净化柱价格昂贵，会增加分析时间，提高价格成本。因此，需要一种更加简便、准确、适应现代化检测需求的新方法。本试验采用改良的QuEchERS技术前处理饲料样品，以乙腈作为萃取溶剂，结合气相色谱—三重四级杆串联质谱法（GC-MS/MS）检测了饲料中20种农药残留，为确保饲料质量安全提供有效的检测方法。1材料与方法1.1材料与试剂青贮玉米饲料为市售，共10份，使用研磨仪粉碎，于2~4 ℃冷藏；敌敌畏、速灭磷、异丙威、禾草敌、硫磷嗪、灭线磷、治螟磷、久效磷、甲拌磷、甲基对硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、五氯硝基苯、杀扑磷、三唑磷、特丁硫磷、毒死蜱、对硫磷、苯硫磷、伐灭磷标准品，纯度≥98.0%，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司；乙腈（色谱纯）购自国药集团化学试剂有限公司；氯化钠（分析纯）购自天津海昌试剂有限公司；丙酮、乙酸乙酯（色谱纯）购自德国Dr. Ehrensorfer公司。1.2仪器与设备QP-2020气相色谱质谱联用仪购自日本岛津公司；Fritsch可变速高速旋转粉碎机购自北京飞驰科学仪器有限公司；DMT-2500多管旋涡混匀仪购自南京互川电子有限公司；LD5-2A台式冷冻离心机购自常州杰博森仪器有限公司；ESJ220-4A全自动电子分析天平购自沈阳龙腾电子有限公司；STRIKE 385旋转蒸发仪购自优莱博技术（北京）有限公司；Smart2Pure超纯水仪购自上海宏宇仪器有限公司。1.3试验方法1.3.1标准溶液的配制贮备液：分别称取农药对照品10.000 mg（精确至0.001 mg）于1 000 mL容量瓶中，使用乙酸乙酯定容至刻度，即得质量浓度为0.01 g/L的标准贮备液。曲线工作液：分别吸取5、10、20、50、100 μL标准贮备液于1.0 mL容量瓶中，使用阴性样品提取液定容至刻度，即得0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/L的标准工作液。1.3.2单因素试验以检测农药的平均回收率为指标，分别设置提取方法（超声波萃取、QuEChERS前处理、加速溶剂萃取）、提取溶剂（丙酮、乙酸乙酯、乙腈）和净化剂［A组为25 mg 乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）+35 mg十八烷基硅烷键合硅胶（C18）+20 mg 石墨化炭黑（GCB）+200 mg无水MgSO4、B组为50 mg PSA+75 mg C18+40 mg GCB+200 mg无水MgSO4、C组为80 mg PSA+110 mg C18+80 mg GCB+200 mg无水MgSO4）］为考察因素进行单因素试验。1.3.3正交试验在单因素试验的基础上，选取提取方法（A）、提取溶剂（B）、净化剂种类（C）进行3因素3水平的正交试验[10]，正交试验的因素水平设计见表1。超声波萃取条件为称取5.0 g样品于100 mL具塞试管中，加入10 mL乙腈后于超声提取仪中提取，提取温度为35 ℃、功率150 W、提取时间为10 min；加速溶剂萃取条件为称取5.0 g样品与2.0 g硅藻土混匀后于加速溶剂萃仪中提取，萃取压力为10.34 MPa、温度为80 ℃，使用10 mL乙腈静态萃取10 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.T001表1正交试验因素水平设计水平A提取方法B提取溶剂C净化剂种类1超声波萃取丙酮25 mg PSA+35 mg C18+20 mg GCB+200 mg无水MgSO4（A组）2QuEChERS萃取乙酸乙酯50 mg PSA+75 mg C18+40 mg GCB+200 mg无水MgSO4（B组）3加速溶剂萃取乙腈80 mg PSA+110 mg C18+80 mg GCB+200 mg无水MgSO4（C组）1.3.4样品的QuEChERS前处理准确称取5.0 g粉碎后的样品，加入10 mL乙腈溶剂旋涡振荡提取30 min，加入4 g氯化钠，剧烈振荡15 min，以5 000 r/min的速度离心10 min。移取上清液2.0 mL加入盛有50 mg PSA、75 mg C18、40 mg GCB、200 mg无水硫酸镁的离心管中，旋涡振荡10 min，以8 000 r/min离心5 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，供GC-MS/MS测定。1.3.5仪器条件1.3.5.1气相色谱条件毛细管柱为DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），溶剂延迟时间3 min，进样口温度250 ℃，进样方式为不分流进样。柱温程序为初始温度为70 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升温至160 ℃，以8 ℃/min升温至280 ℃，保留6 min。载气为高纯氦气，纯度≥99.999%。载气控制方式恒线速度，线速度为47.6 cm/s。高压进样压力250 kPa，柱流量1.05 mL/min，进样量：1 µL。1.3.5.2质谱条件电离方式为电子轰击源（electron impact, EI)，离子源温度200 ℃。碰撞诱导解离气为高纯氩气，纯度≥99.999%。色谱质谱接口温度250 ℃，电离能量70 eV，检测器电压1.5 kV，采集方式多反应监测。2结果与分析2.1质谱条件的优化选取一种青贮玉米饲料样品为基质，准确称取5.0 g粉碎后的样品于50 mL离心管中，加入10 mg/L的20种农药混标溶液10 μL，按照1.3.3节方法对样品前处理及上机分析。在质荷比为40~500 amu范围内进行全扫描，得到20种农药的总离子流色谱图，见图1。根据全扫描数据确定各目标化合物的母离子和保留时间，采用子离子扫描方式得到产物离子，优化碰撞能量获得响应最高的子离子。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.F001图1样品加标后20种农药的总离子色谱图（20.0 μg/kg）注：1为敌敌畏；2为速灭磷；3为异丙威；4为禾草敌；5为硫磷嗪；6为治螟磷；7为治螟磷；8为久效磷；9为甲拌磷；10为甲基对硫磷；11为马拉硫磷；12为杀螟硫磷；13为五氯硝基苯；14为杀扑磷；15为三唑磷；16为特丁硫磷；17为毒死蜱；18为对硫磷；19为苯硫磷；20为伐灭磷；下图同。利用质谱多反应监测（MRM）模式扫描，选择质荷比较大、丰度较强的两对特征离子作为定量和定性离子。为获得最佳的质谱条件确保各目标化合物定性和定量的准确性，对目标化合物的母离子、产物离子、碰撞能量等质谱条件进行优化，获得较理想的质谱条件及分离效果。20种农药标准物质经优化后得到的质谱条件参数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.T002表220种农药标准物质经优化后得到的质谱条件参数序号农药名保留时间/min定量离子对及碰撞电压/eV定性离子对及碰撞电压/eV1敌敌畏10.09818593（14）185109（14）2速灭磷10.235192164（4）192127（12）3异丙威10.318136121（10）136103（22）4禾草敌10.48612655（14）12683（6）5硫磷嗪10.59214379（15）14352（25）6灭线磷11.082200158（15）200114（14）7治螟磷11.213322294（6）322202（10）8久效磷11.456127109（4）12795（16）9甲拌磷11.60126075（12）260231（4）10甲基对硫磷11.832263109（10）263136（16）11马拉硫磷12.08317399（14）173127（6）12杀螟硫磷12.235277260（6）277109（16）13五氯硝基苯12.421294236（16）294264（12）14杀扑磷12.60114585（8）14558（14）15三唑磷12.784257162（8）257134（22）16特丁硫磷12.901231174（4）231128（18）17毒死蜱13.088314258（12）314286（26）18对硫磷13.189291109（8）291137（14）19苯硫磷13.492297269（24）297223（12）20伐灭磷13.723322156（14）32297（18）2.2单因素试验结果2.2.1提取方法对检测农药平均回收率的影响（见图2）由图2可知，超声波萃取、QuEChERS萃取、加速溶剂萃取的平均回收率分别为85.34%、89.87%、84.43%。超声波萃取与加速溶剂萃取能耗较高、溶剂用量较大，且对样品萃取后农药平均回收率低于QuEChERS萃取。因此，本试验选择QuEChERS萃取作为样品的提取方法。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.F002图2提取方法对回收率的影响2.2.2提取溶剂对检测农药平均回收率的影响（见图3）由图3可知，丙酮、乙酸乙酯、乙腈作为样品的萃取溶剂时，农药平均回收率分别为85.67%、83.12%、89.87%。因此，选择乙腈作为样品的萃取溶剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.F003图3提取溶剂对回收率的影响2.2.3净化剂对检测农药平均回收率的影响（见图4）由图4可知，选择3组净化剂对样品提取液进行净化，A组、B组、C组农药平均回收率分别为84.56%、89.54%、85.26%。因此，选择农药平均回收率较高的B组作为净化剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.F004图4净化剂对回收率的影响2.3正交试验结果及方差分析结果（见表3、表4）由表3、表4及F检验结果分析可知，提取溶剂（B）与净化剂（C）对农药加标平均回收率具有显著影响（P0.05），而提取方法（A）对农药加标平均回收率的作用不显著（P0.05）。各因素对农药平均回收率的影响顺序为CBA，即净化剂提取溶剂提取方法。通过k值比较得到本试验最佳因素组合为A2B3C2。验证试验测得20种农药的平均回收率为89.45%，高于表3中20种农药平均回收率的最大值85.71%。因此，该正交试验的最佳条件确定为A2B3C2，即选择QuEChERS作为样品提取方法、提取溶剂为乙腈、净化剂为50 mg PSA+75 mg C18+40 mg GCB+200 mg无水MgSO4进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.T003表3正交试验结果试验号ABC回收率/%111170.43212285.71313382.27421284.72522384.67623183.36731382.58832180.94933286.76k179.4779.2478.24k284.2583.7785.73k383.4384.1383.17R4.784.897.49最优组合A2B3C210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值A39.181219.59118.5340.05B44.528222.26421.0630.05C86.892243.44641.1030.05误差2.11421.057总和172.71582.4方法学验证2.4.1线性回归方程、检出限及定量限将标准曲线最低点工作液经适当稀释后加入5.0 g阴性饲料样品中，按照1.3节步骤操作得到样品提取液进行上机分析，以其产生的3倍信噪比（S/N=3）计算方法检出限[11-13]，10倍信噪比（S/N=10）计算方法定量限[14-17]。各农药的线性方程、相关系数（R2）、方法检出限以及方法定量限见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.T005表5各农药的回归方程及相关信息序号农药名CAS号基质配标线性回归方程R2线性范围/（mg/L）基质效应（ME）检出限/（μg/kg）定量限/（μg/kg）1敌敌畏62-73-7Y=411 779.04X+1 965.750.999 50.05~1.000.6711.1213.7372速灭磷7786-34-7Y=180 304.77X-6 126.760.998 50.05~1.000.8640.5411.8033异丙威2631-40-5Y=877 629.38X-23 263.470.999 90.05~1.001.8210.6892.2974禾草敌2212-67-1Y=237 958.90X-11 678.790.998 80.05~1.000.6451.4014.8175硫磷嗪297-97-2Y=297 025.45X-6 490.210.999 30.05~1.001.5420.1240.4136灭线磷13194-48-4Y=304 497.18X-8 335.550.998 90.05~1.002.1212.1417.1377治螟磷3689-24-5Y=156 811.19X-9 206.340.996 40.05~1.000.3123.45110.5308久效磷6923-22-4Y=360 046.18X-12 867.480.998 00.05~1.003.1250.6542.1809甲拌磷298-02-2Y=857 252.96X-31 336.390.998 40.05~1.001.7851.4514.83710甲基对硫磷298-00-0Y=490 535.61X-13 148.770.999 20.05~1.004.6514.35111.53011马拉硫磷121-75-5Y=490 663.25X-20 250.810.997 40.05~1.000.1241.5514.93712杀螟硫磷122-14-5Y=1 343 315.56X-4 869.920.998 80.05~1.002.4570.5871.95713五氯硝基苯82-68-8Y=123 070.38X-6 134.040.997 00.05~1.003.4510.6742.24714杀扑磷950-37-8Y=107 475.35X-5 946.080.996 60.05~1.000.2450.1670.55715三唑磷24017-47-8Y=547 131.29X-13 157.970.997 30.05~1.001.3582.4748.24716特丁硫磷13071-79-9Y=647 540.68X-31 354.450.997 00.05~1.002.4511.3654.55017毒死蜱2921-88-2Y=72 782.23X-2 976.620.996 90.05~1.001.0873.21410.71018对硫磷56-38-2Y=212 520.51X-11 166.780.997 10.05~1.003.1244.23513.11019苯硫磷2104-64-5Y=442 981.66X-12 399.410.999 00.05~1.000.3455.32414.11020伐灭磷52-85-7Y=91 653.89X-4 683.540.996 40.05~1.002.6871.4712.572由表5可知，在质量浓度为0.05~1.00 mg/L范围内方法线性良好，相关系数（R2）为0.996 4~0.999 9，方法检出限为0.124~5.324 μg/kg，方法定量限为0.413~14.11 μg/kg，符合痕量分析要求。2.4.2精密度和加标回收率试验选取其中一种饲料样品（编号：S1）为基质，加入20种农药标准溶液，其加标水平为20、60、100 μg/kg，测定加标回收率与精密度，各水平重复测定6次，计算加标平均回收率与相对标准偏差（RSD），以相对标准偏差考察方法的精密度，20种农药的精密度和加标回收率试验结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.T006表620种农药的精密度和加标回收率试验（n=6）序号农药名本底值/(μg/kg)20 μg/kg60 μg/kg100 μg/kg回收率/%RSD%回收率/%RSD%回收率/%RSD%1敌敌畏22.0085.117.2583.485.64102.327.352速灭磷ND101.215.4696.565.6689.651.233异丙威ND91.255.12103.459.1285.472.454禾草敌ND78.251.2580.451.0283.212.875硫磷嗪ND87.698.2379.653.4591.253.466灭线磷ND89.650.8989.655.4480.985.477治螟磷ND102.451.35104.255.8779.657.698久效磷ND86.554.2679.656.8983.459.469甲拌磷15.9090.213.4776.697.8890.248.4510甲基对硫磷ND76.355.6489.6510.2379.212.3111马拉硫磷ND83.645.1489.125.14104.5611.0012杀螟硫磷ND94.566.2579.656.2592.3512.0013五氯硝基苯ND82.158.4799.659.4588.5613.0014杀扑磷ND84.9810.2591.248.6979.6114.0015三唑磷ND79.656.4786.327.45101.4715.0016特丁硫磷ND93.224.5686.3210.3291.2316.0017毒死蜱ND78.566.7891.269.6586.3217.0018对硫磷19.9076.548.14104.235.2381.2518.0019苯硫磷ND98.363.1281.252.5479.6519.0020伐灭磷ND104.560.8997.657.8493.1220.00注：“ND”表示未检出。由表6可知，各农药的加标平均回收率为76.35%~104.56%，回收率试验结果RSD为0.89%~11.45%（n=6），符合痕量分析要求。2.5实际样品检测利用上述所建立的方法对市售10批次青贮玉米饲料进行农药残留检测分析，检测结果见表7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.023.T007表7饲料样品的检测结果样品编号敌敌畏久效磷甲拌磷马拉硫磷毒死蜱对硫磷S10.022—0.015 9——0.019 9S2—0.0510.045 0———S30.0280.018————S4—0.041—0.0250.045—S50.044——0.0370.037—S6———0.012——S70.034—0.125 0——0.087 0S8—0.031——0.078—S9————0.0660.095 0S100.019——0.0290.076—注：“—”表示未检出。mg/kg由表7可知，所测样品均有不同程度农药检出呈阳性，主要包括敌敌畏、久效磷、甲拌磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷。所测样品中敌敌畏、毒死蜱的检出率最高均为50%，含量分别为0.019~0.044、0.037~0.078 mg/kg；久效磷与马拉硫磷的检出率均为40%，其含量值分别为0.018~0.051、0.012~0.037 mg/kg；甲拌磷与对硫磷的检出率均为30%，其含量分别为0.045~0.125、0.019 9~0.095 0 mg/kg。根据《国际食品饲料中农药残留限量法规》的相关规定，拟定敌敌畏、久效磷、甲拌磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷的最大残留限量值（MRLs）分别为0.2、0.2、1.0、0.1、0.5、0.6 mg/kg，所检测样品中呈阳性的农药均未超过相应规定限量值。3讨论农产品样品组织复杂，基质成分与目标物相差较大，并且存在农药的同系物、异构体、降解产物、代谢产物和轭合物的影响，从而增加了农药残留分析的难度。农药残留分析中需要尽可能地将目标物溶入提取液中，通过净化剂去除提取液中杂质的干扰，减少杂质色谱峰的影响，避免对色谱柱和检测器的污染。因此，在农药残留分析中，根据不同样品的性质选择不同提取溶剂及净化剂种类对分析结果的准确性至关重要。当提取溶剂及净化剂种类确定后，选择不同提取方法均能满足《实验室质量控制规范 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）及《农药残留检测方法国家标准编制指南》（农业农村部公告2386号）中相应参数要求。李志等[18]选择正己烷作为提取溶剂、PSA-C18(1∶1）作为净化剂，探讨超声波萃取、QuEChERS前处理、加速溶剂萃取等不同提取方法对刺梨中15种有机氯农药的残留分析。结果显示，3种提取方法的回收均满足农产品中农药痕量分析要求。高效的提取试剂和净化材料可以适应现代化检测需求的新方法，在农药残留分析领域具有广泛的应用前景。4结论本研究采用市售10批次青贮玉米饲料为研究对象，采用QuEChERS前处理技术结合气相色谱-三重四级杆串联质谱法对10批次青贮玉米饲料中的20种农药残留进行定性、定量分析。该方法前处理操作简单、重复性好、灵敏度高，各农药在质量浓度为0.05~1.00 mg/L范围内线性关系良好，R2≥0.996 4，方法检出限为0.124~5.324 μg/kg，方法定量限为0.413~14.110 μg/kg。20种农药在20、60、100 μg/kg的加标浓度下，各农药的平均加标回收率为76.35%~104.56%，回收率试验结果RSD为0.89%~11.45%(n=6)。相比传统农药残留检测方法，该方法具有消除基质干扰、减少假阳性检出率、提高分析检测效率、降低分析成本的优点，能够为饲料质量安全提供有效的检测。