金黄色葡萄球菌，又称金葡菌是自然界常见的食源性致病菌，其分泌的毒素通常会感染并损伤人类和动物机体皮肤、烧伤创面、呼吸道和肠道等组织，临床表现为皮炎、化脓性感染、鼻炎、乳房炎、败血症和食物中毒等多种病症[1-2]。在临床中应用抗生素能够有效改善金葡菌的感染。但随着抗生素的广泛使用，金葡菌的耐药性增强，临床预防和治疗金葡菌感染成为难题之一，因此需要研究高效、安全性高的新型抗菌药物[3]。目前，中草药在预防和治疗细菌感染上备受关注[4]，已广泛应用于农业、食品、医药等领域。厚朴为木兰科植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮[5]。研究发现，厚朴提取物能够有效改善家禽（育肥猪、黄羽肉鸡等）的生长性能和肉质，提高经济效益[6-7]，这与厚朴具有抗氧化、抗炎、抗菌等多种药理活性相关。在抑菌方面，厚朴已被证实具有显著的抑菌活性，尤其是对金葡菌的抑制效果[8]。厚朴中酚类成分，厚朴酚和厚朴酚能够抑制金葡菌的自溶酶和肠毒素的表达，从而降低金葡菌的自溶性和毒力[9]。研究表明，厚朴叶挥发油对金葡菌存在明显的抑制作用[10]。中药厚朴来源于凹叶厚朴和厚朴2种基源植物，药用部位在皮部，2种基源植物皮部挥发油成分之间抑菌作用的对比尚未被报道。因此，本试验初步探究了中药厚朴的2种基源植物皮部挥发油的成分差异及其对金葡菌的抑菌作用，旨为中草药抑菌剂的研发提供参考。1材料与方法1.1试验材料凹叶厚朴与厚朴（皮部）由成都国际商贸城提供。金葡菌ATCC25923、耐甲氧西林金葡菌ATCC33591、ATCC43300由四川省抗菌研究所提供，金葡菌临床分离株、耐甲氧西林金葡菌临床分离株来自临床分离。二甲基亚砜（DMSO)、正己烷（分析纯）均购自成都市科龙化工试剂厂，MH琼脂购自杭州百思生物技术有限公司，阿莫西林购自中诺药业有限公司。1.2试验仪器HX-200高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂），索氏提取器（成都长征化玻有限公司），BS200S精密电子天平（上海一恒科学仪器有限公司），电热套（北京中兴伟业仪器有限公司），DHP-9050B智能型电热恒温培养箱（上海琅轩实验设备有限公司），GC5975C/MS7890A气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent公司），MIT-P细菌多点接种仪（日本佐久间公司）。1.3测定指标及方法1.3.1挥发油的提取与供试液的制备1.3.1.1挥发油的提取将凹叶厚朴和厚朴药材粉碎，分别在10 000 mL水蒸气蒸馏提取器中放置2种对应的药材粉末500 g，加入5 000 mL蒸馏水，电热套加热8 h，保持微沸状态；当油状提取物不再增加时，收集后密封，4 ℃冰箱保存；若蒸馏物中含有水渍，加入适当无水硫酸钠除去。挥发油得率=挥发油提取量/样品质量×100%(1)1.3.1.2供试液的制备使用正己烷将10 μL各样品挥发油溶解，稀释100倍，经无水硫酸钠干燥，0.22 μm的微孔滤膜过滤，得到供试液。1.3.2GC-MS测定条件气相色谱条件：HP-5MS色谱柱（规格：30 m × 250 μm × 0.25 μm），初始温度为60 ℃，以10 ℃/min升温速率升至90 ℃；以2 ℃/min升温速率升至140 ℃；以1 ℃/min升温速率升至150 ℃，保持2 min；以10 ℃/min升温速率升至250 ℃。高纯氦气为载气，体积流量1 ℃/min，分流比1︰5，进样量1 μL。质谱条件：EI离子源，电子能量为70 eV，离子源温度230 ℃，全扫描。质谱检索标准谱库为NIST MS search 2.0。1.3.3抑菌活性1.3.3.1菌种培养利用划线法，将10种金色葡萄球菌接种于已灭菌的MH琼脂培养基平板上，分别扣入皿盖，标记，37 ℃恒温箱孵育18 h，观察菌落分布，记录菌落特征。1.3.3.2待测样品的制备将凹叶厚朴与厚朴挥发油配制为初始浓度为30 μL/mL的溶液，溶剂为DMSO。利用二倍稀释法将初始溶液稀释为5个梯度。依次吸取1 mL各浓度溶液加入,含有14 mL培养基的培养皿中，混匀，制备含药培养基（浓度分别为0、0.125、0.500、1.000、2.000 mL/L）。阳性对照组为阿莫西林。1.3.3.3最小抑菌浓度（MIC）测定利用接种环将试验所用的10种金葡菌从培养皿转移至装有2 mL生理盐水的各个试管中，采用比浊法计数。在各试管中加入一定量的无菌生理盐水，将各菌液浓度稀释至1.5×106 CFU/mL。分别吸取20 µL稀释后的菌液加入装有2 mL生理盐水的各接种试管中，混匀；将接种试管中的菌种用点样仪分别接种于各含药培养基上，37 ℃恒温培养箱中培养18 h，观察结果。2结果与分析2.1挥发油的提取结果试验分别获得3.0 mL凹叶厚朴油、3.2 mL厚朴油，有刺激性气味，挥发油得率分别为0.60%、0.64%。2.2挥发油GC-MS分析（见图1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.020.F001图1挥发油的总离子流图注：S1为凹叶厚朴；S2为厚朴。凹叶厚朴与厚朴挥发油经计算机核对和质谱解析共鉴定出50种化合物。凹叶厚朴与厚朴挥发油中鉴定出的化合物种类分别为39、40种，二者共有峰29个，合计占各自挥发油百分含量依次为85.07%、88.64%。凹叶厚朴与厚朴主要挥发油成分见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.020.T001表1凹叶厚朴与厚朴主要挥发油成分项目化学式化合物名称相对百分含量/%凹叶厚朴厚朴1C10H16水芹烯0.121.832*C10H16（+）-柠檬烯2.912.883C10H18O桉叶油素0.95—4C10H16β-苯丙氨酸—3.275C10H14邻-异丙基苯3.946.016*C10H18O芳樟醇4.951.927C12H20O2（-）-冰片醇乙酸酯0.231.508C15H24（-）-反式石竹烯1.336.459C15H24α-律草烯1.012.8610C15H24γ-衣兰油烯0.770.8011*C10H18Oα-松油醇2.020.4512C10H18O冰片1.061.6013*C15H24β-芹子烯2.332.2114C15H24α-芹子烯2.613.0715C15H24Δ-杜松烯2.002.8416*C8H12O3-（1-甲基乙基）-2-环戊烯-1-酮0.710.3817*C15H22去氢白菖烯0.560.4218*C15H20α-二去氢菖蒲烯0.660.3519*C15H24O氧化石竹烯4.673.2320*C10H162，5-二甲基-3-乙烯基-1，4-己二烯0.510.1921*C15H24O环氧化蛇麻烯Ⅱ2.490.9222C15H26Oγ-桉叶油醇10.0911.1123C15H24白菖烯2.472.8824C15H24马兜铃烯1.59—25C15H26O茅苍术醇1.071.1826C15H24（-）-α-蒎烯0.630.4627*C15H26Oα-桉叶醇18.6017.9428*C15H26Oβ-桉叶醇16.2713.92注：1.“—”表示未检出。2.“*”表示在凹叶厚朴挥发油中的百分含量大于厚朴。由表1可知，凹叶厚朴中特有成分有10种，相对百分含量高于0.5%的成分有2种，分别为桉叶油素（0.95%）和马兜铃烯（1.59%）。厚朴中特有成分有11种，相对百分含量高于0.5%的有β-苯丙氨酸（3.27%）。凹叶厚朴挥发油中相对百分含量大于厚朴的共有成分有12种，如芳樟醇（4.95%1.92%）、α-松油醇（2.02%0.45%）、氧化石竹烯（4.67%3.23%）、α-桉叶醇（18.60%17.94%）、β-桉叶醇（16.27%13.92%）等，合计占各自挥发油的百分含量依次为58.25%、46.02%。2.3抑菌试验测定结果凹叶厚朴与厚朴挥发油抑菌试验结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.020.T002表2凹叶厚朴与厚朴挥发油抑菌试验结果序号细菌名称MIC凹叶厚朴厚朴阿莫西林1金葡菌标准株ATCC259230.5002.0000.1252金葡菌临床分离株10.5002.0000.1253金葡菌临床分离株20.5002.0000.2504金葡菌临床分离株31.0002.0000.1255耐甲氧西林金葡菌标准株ATCC335910.5002.0000.1256耐甲氧西林金葡菌标准株ATCC433000.5002.0000.1257耐甲氧西林金葡菌临床分离株10.5002.0000.2508耐甲氧西林金葡菌临床分离株20.5002.0000.5009耐甲氧西林金葡菌临床分离株31.0002.0000.12510耐甲氧西林金葡菌临床分离株40.2501.0000.500mL/L由表2可知，凹叶厚朴与厚朴挥发油对10种金葡菌均有抑菌作用。凹叶厚朴挥发油对10种金葡菌的MIC范围为0.250~1.000 mL/L，厚朴挥发油的MIC范围为1.000~2.000 mL/L；与厚朴挥发油相比，凹叶厚朴挥发油的10种金葡菌MIC值均较小，表明凹叶厚朴对金葡菌的抑菌活性高于厚朴；凹叶厚朴挥发油对金葡菌标准株ATCC25923、金葡菌临床分离株1和2、耐甲氧西林金葡菌标准株ATCC33591、耐甲氧西林金葡菌标准株ATCC43300、耐甲氧西林金葡菌临床分离株1、2和4等8种金葡菌的抑菌效果高于厚朴挥发油。3讨论中药挥发油提取于天然植物，具有药理活性多、安全性高及残留率低的优势，有助于提升动物的生产性能[11]。挥发油的抑菌活性对新型饲料添加剂的研究具有重要意义，如山苍子挥发油添加在动物饲粮中能够作为高效饲料的防霉剂[12]；丁香挥发油可调节母牛瘤胃中的菌群代谢，优化牛乳质量[13]；小茴香和草果挥发油可增强动物生长性能和免疫能力，降低胃肠细菌感染风险[14-15]。研究表明，含有酚类、醇类和醛类基团的挥发油成分具有明显的抑菌能力，如丁香[16]、肉桂[17]和茉莉[18]。凹叶厚朴[19-20]和厚朴[21-22]挥发油被报道含有萜烯类、萜醇类、倍半萜类、高级脂肪烷烃类以及含氧衍生物等成分，含量较高的桉油醇及其同分异构体较为突出，桉油醇及其同分异构体有可能成为取代抗生素类饲料添加剂的候选之一。目前，尚无研究对凹叶厚朴和厚朴挥发油成分进行比较，因此，本研究比较凹叶厚朴与厚朴挥发油的化学组成及抑菌活性差异性，旨在为厚朴作为抗生素代替品以及临床上作为抑菌剂的合理用药提供参考。GC-MS分析结果表明，凹叶厚朴与厚朴挥发油鉴定出的化合物种类和共有峰百分比合计总量都较为接近，说明二者在化学成分上有一定的相似性。在特有成分方面，凹叶厚朴挥发油有10种、厚朴挥发油有11种；凹叶厚朴挥发油中的特有成分含量大于厚朴的高达12种，合计后占各自挥发油百分含量具有明显差异（58.25%46.02%），表明二者在化学成分上有一定的差异性。凹叶厚朴与厚朴挥发油的抑菌试验表明，凹叶厚朴与厚朴挥发油对10种金葡菌均具有抑菌效果；凹叶厚朴对ATCC25923等8种金葡菌的抑菌效果明显优于厚朴，可能与凹叶厚朴中所含的特有成分及含量相关。体外抑菌研究表明，R-和S-芳樟醇对金葡菌（ATCC29213、25923）具有抗菌活性，MIC值为4.096 g/L，R-芳樟醇的抗菌活性稍强于S-芳樟醇[23]；α-松油醇及其2种同分异构体松油烯-4-醇和δ-松油醇也被证实对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出抑制作用，MIC范围在0.3900~1.5625 μL/mL之间[24]；以α-、β-、γ-桉叶醇为主要成分（依次为51.60%、23.70%、14.56%）的G. blepharophylla叶油也被评估出对11种微生物有一定的抑制作用[25]。因此，芳樟醇、α-松油醇、β-桉叶醇等化合物，可能是导致凹叶厚朴对金葡菌的抑菌效果均明显优于厚朴的主要成分，说明在抗菌疗效上凹叶厚朴挥发油可能优于厚朴。鉴于厚朴其他非挥发性成分亦有一定抗菌活性[26]，且本研究选取的样本数目较少，尚需进一步扩大样本量，对不同品种厚朴组成成分的抗菌活性作进一步分析和评价。4结论凹叶厚朴与厚朴挥发油化学组成具有一定差异性。凹叶厚朴与厚朴挥发油对10种金黄色葡萄球菌均具有抑制作用，但凹叶厚朴挥发油较厚朴挥发油抗菌活性强，可能与凹叶厚朴中芳樟醇、α-松油醇、β-桉叶醇等含量更高有关。本试验可为中草药添加剂的开发应用及抑菌剂的研发提供参考。