变形杆菌属于革兰阴性菌肠杆菌科，是人畜共患菌。奇异变形杆菌（Proteus mirabilis，PM）在自然界广泛分布，可通过粪便、饮水等途径感染人或动物，引起败血症、食物中毒、腹泻、泌尿系统等疾病[1]。近年来，随着PM耐药性增加，抗生素防控效果急剧下降。因此，开发新型抗菌剂对降低细菌耐药率尤为重要。甘草作为较为常见的中药，主要分布在我国西北部，其根部是常见用药部位。甘草提取物包括黄酮类、淀粉、氨基酸、糖类等。甘草多糖（Glycyrrhiza polysaccharide，GUP）是一种从甘草中提取出来的天然多糖，具有抗炎抑菌、抗氧化、免疫调节、抗肿瘤等功能[2]。硒作为人体必需元素，能够保障机体健康，降低癌症、甲状腺、大骨病等疾病风险；还具有抗氧化、抗癌、抗炎抑菌、提高机体免疫力等生物学功能。硒分为无机硒和有机硒。无机硒毒副作用大、生物利用率低；有机硒比无机硒毒副作用小，利用率高，能够与大分子结合，在生物活性方面产生协同作用[3]。将硒与甘草多糖结合为硒化甘草多糖（selenide Glycyrrhiza polysaccharide，SeGUP），具有抗炎抑菌、免疫调节等作用。研究表明，GUP对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌具有较好的抑制作用[4]；SeGUP对大肠杆菌有抑制作用[5]；PM对氨基糖苷类、青霉素类、喹诺酮类抗生素呈不同程度耐药[6-8]。本试验研究SeGUP、GUP联合抗生素对PM体内外抑菌效果及抑菌机制，比较两者抑菌性效果，旨在开发新型天然植物抑菌剂、临床抗生素使用以及PM的防治方面提供参考。1材料与方法1.1试验动物昆明级小鼠，240只，雌、雄各半，7~9周龄，体重（20±2）g，由新疆医科大学医学实验动物中心提供，适应性饲养7 d后用于试验。1.2试验菌株及试验试剂奇异变形杆菌（Proteus mirabilis，菌株编号为BNCC107943）购自BeNa Culture Collection；新疆乌拉尔甘草购自石河子市国浩中草药公司；BHI、营养肉汁琼脂购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；G-100葡聚糖购自合肥博美生物科技有限责任公司；抗生素药敏片（恩诺沙星、环丙沙星（CI）、新霉素硫酸盐、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、阿莫西林、氨苄西林）购自杭州微生物试剂有限公司；CI、碱性磷酸酶（AKP）试剂盒、BCA法蛋白含量测定试剂盒、β-半乳糖苷酶（β-gal）试剂盒、过氧化氢酶（CAT）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；亚硒酸钠购自天津福晨化学试剂厂；透析袋、琼脂粉购自北京博奥拓科技有限公司。1.3试验仪器Biotek SynergeyTM2多功能酶标仪（美国伯腾仪器有限公司）；DEAE-52层析柱、Sephadex G-100层析柱（北京博奥拓达科技有限公司）；ZG-280中药煎药包装一体机（吉首市中诚制药机械厂）；冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）；高速冷冻离心机（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；HVA-85高压蒸汽灭菌锅（华粤行仪器有限公司）；单道排枪移液器、多道排枪移液器（德国Transferpette公司）。1.4试验活化菌株在超净工作台中将密封的PM试管用磨砂石打开，将无菌液体培养基打入PM试管中，混匀；再蘸取PM菌悬液在固体培养基中划线，37 ℃恒温培养16 h；选取大小均一的单菌落，置于液体培养基中，37 ℃恒温培养18 h，用无菌蒸馏水调整菌液浓度为108 CFU/mL。1.5测定指标及方法1.5.1GUP制备根据参考文献[9]的方法，取干燥的新疆乌拉尔甘草1 000 g，工业乙醇浸泡12 h除去脂质小分子。热水回流提取3次，加入无水乙醇使终体积分数为80%、静置8 h，去除上清液，3 000 r/min离心15 min，取浓缩液，冷冻干燥后得到新疆乌拉尔甘草粗多糖。将粗多糖配制成10 g/L溶液，调溶液pH值为7.0，加三氯乙酸搅拌4 h，加入过氧化氢，50 ℃水浴静置3 h。将以上处理过的溶液装入透析袋，蒸馏水透析72 h，放置层析柱除杂，离心除去沉淀，冷冻干燥，即为GUP。1.5.2SeGUP制备称取500 mg GUP，加入浓硝酸50 mL，搅拌30 min，加入200 mg亚硒酸钠，水浴8 h，加饱和无水碳酸钠，调pH值为6.0，3 000 r/min离心15 min，去除沉淀。将以上处理过的溶液装入透析袋，蒸馏水透析48 h，放置层析柱除杂，冷冻干燥后得即为SeGUP。1.5.3体外抑菌试验1.5.3.1药敏试验将SeGUP、GUP用无菌水调制成浓度分别为100、200、300、400 g/L的溶液，再将溶液、自制药敏片进行高压灭菌。将药敏纸片均匀放置在无菌玻璃器皿上，吸取20 µL不同浓度的SeGUP、GUP放置在药敏片上，4 ℃放置4 h，在37 ℃烘箱中烘干。将PM均匀涂布在固体培养基上直至干涩难涂，使用无菌眼科镊夹将制备好的不同质量浓度SeGUP、GUP药敏片以及各抗生素药敏片均匀放置在固体培养基上，保持间距，37 ℃恒温培养24 h，观察抑菌圈，测量抑菌圈直径，以3次抑菌圈直径的平均值为敏感度标准。根据《中药药理学标准》，抑菌圈直径≥20 mm为极度敏感；15 mm≤抑菌圈直径＜19 mm为高度敏感；10 mm≤抑菌圈直径＜14 mm为中度敏感；抑菌圈直径＜10 mm为无抑菌活性。1.5.3.2最小抑菌浓度（MIC）测定参考林震等[10]以及实验室前期方法稍做改动，使用无菌蒸馏水配制不同浓度的SeGUP、GUP、抗生素溶液，多糖溶液高压灭菌，准备3块96孔板，吸取100 µL不同质量浓度的SeGUP、GUP、抗生素溶液分别加入不同板中，加入100 µL菌悬液，SeGUP、GUP溶液终质量浓度分别为25、50、75、100、125、150、175、200、225、250 g/L；抗生素溶液终质量浓度分别为320×10-3、160×10-3、80×10-3、40×10-3、20×10-3、10×10-3、5×10-3 g/L；对照组为只含PM的菌悬液。37 ℃恒摇床振荡培养24 h，与对照组比，孔中无浑浊即为MIC。试验重复3次。1.5.3.3SeGUP、GUP对PM的生长曲线参考Liu等[11]以及实验室前期方法适当修改，采用二倍稀释法，使用无菌蒸馏水分别配制2 MIC、1 MIC、0 MIC SeGUP和GUP溶液，高压灭菌，将PM菌悬液放置在无菌试管中，加入等量、不同质量浓度的SeGUP、GUP溶液，SeGUP、GUP溶液终质量浓度分别为1 MIC、1/2 MIC、0 MIC。37 ℃恒温摇床振荡培养24 h，每隔2 h测定在OD600 nm处的吸光度值。以时间为横坐标，OD600 nm值为纵坐标，绘图。1.5.3.4SeGUP、GUP和抗生素组合体外协同试验参考Li等[12]以及实验室前期方法稍做改动，采用棋盘法测定SeGUP、GUP联合抗生素抑菌效果，将50 µL不同浓度的SeGUP、GUP溶液提前加入2个不同的96孔板中，每板中分别加入50 µL不同浓度的抗生素溶液，每孔加入100 µL的PM菌悬液，SeGUP质量浓度分别为20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 g/L；GUP质量浓度分别为40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115 g/L；抗生素质量浓度分别为5×10-3、10×10-3、15×10-3、20×10-3、25×10-3、30×10-3、35×10-3、40×10-3 g/L。对照组为只含PM菌悬液，37 ℃恒温培养24 h，与对照组比，孔中无浑浊为联合后抗生素的MIC。体外协同作用（FICI）=（甲药联合时的MIC/甲药单用时的MIC）+（乙药联合时的MIC/乙药单用时的MIC）(1)结果判定：FICI≤0.5为协同；0.5FICI≤1.0为相加；1.0FICI≤2.0为无关；FICI＞2.0为拮抗。1.5.4体内抑菌预试验1.5.4.1PM菌悬液制备取大小均一的PM菌落接种到液体培养基中，37 ℃恒温振荡培养18 h，用无菌蒸馏水调整PM菌液浓度为1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108 CFU/mL。1.5.4.2小鼠80%致死剂量（MLD）将80只昆明级小鼠随机分为8组，每组10只，对照组腹腔注射生理盐水，其他6组腹腔注射不同浓度菌液，0.3 mL/只，观察7 d。使用10只小鼠作为验证组，给予80% MLD菌液，验证此剂量小鼠死亡率，确定小鼠80% MLD，即为感染量。1.5.4.3抗生素最佳预防剂量将70只昆明级小鼠随机分为7组：2 mg/kg组、3 mg/kg组、4 mg/kg组、5 mg/kg组、6 mg/kg组、7 mg/kg组、对照组，每组10只。每组小鼠灌服相应剂量抗生素，对照组灌服生理盐水，0.3 mL/只，连续14 d。末次灌服完成2 h后腹腔注射80% MLD菌液，观察7 d。1.5.5体内抑菌试验90只昆明级小鼠随机分为SeGUP高、中、低（150、100、50 mg/kg）剂量组及GUP高、中、低剂量组（150、100、50 mg/kg）和对照组、模型组、抗生素组，每组10只。模型组小鼠不处理，对照组灌服生理盐水，抗生素组灌服最佳预防浓度的抗生素溶液，其余各组灌服0.3 mL/只、不同剂量的SeGUP、GUP溶液，连续14 d。末次灌服完成2 h后，除对照组外，其他组腹腔注射80% MLD的菌液。观察7 d。1.5.6抑菌机制试验1.5.6.1SeGUP、GUP联合抗生素对PM AKP、β-gal、DNA、蛋白含量的影响将相同体积药物分别加入只装有PM菌液高压灭菌的试管中，使浓度分别为MIC SeGUP、MIC GUP、MIC CI、MIC（SeGUP+CI）、MIC（GUP+CI）、1/2 MIC SeGUP、1/2 MIC GUP、1/2 MIC CI、1/2 MIC（SeGUP+CI）、1/2 MIC（GUP+CI），对照组只加入同等体积的无菌蒸馏水（只含PM菌液），37 ℃恒温振荡培养12 h，4、12 h无菌取样1 mL于无菌EP管中，按照AKP、β-gal、DNA、蛋白含量试剂盒使用说明书步骤测量其在OD450 nm、OD260 nm、OD280 nm、OD562 nm吸光度值，得出AKP、β-gal、DNA、蛋白含量变化。每个样品做3个平行，取平均值。1.5.6.2SeGUP、GUP联合抗生素对PM生物膜形成的影响参考温燕龙等[13]和Djordjevic等[14]方法稍作改进。分组同1.5.6.1，将SeGUP、GUP、抗生素溶液与PM菌液振荡混匀，吸取200 µL的混合液到96孔板中，37 ℃培养24 h；弃去每孔中的混合液，使用无菌PBS漂洗3次；再取200 µL结晶紫染液加到每孔中，37 ℃染色1 h，弃去每孔中的染色液，使用无菌PBS漂洗3次；再吸取200 µL的95%乙醇加入每孔中，37 ℃脱色8 h，测定在OD595 nm处吸光度值。每个样品做3个平行，取平均值。1.5.6.3SeGUP、GUP联合抗生素对PM CAT、SOD活性的影响分组以及药物处理同1.5.6.1，根据CAT、SOD试剂盒说明书测定在OD240 nm、OD450 nm处吸光度值，得出CAT、SOD活性变化。每个样品做3个平行，取平均值。1.6数据统计与分析采用SPSS 21.0软件对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's检验法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.01表示差异极显著。采用Graphpad prism 7软件绘图。2结果与分析2.1体外抑菌试验结果2.1.1SeGUP、GUP对PM药敏的试验结果（见表1）由表1可知，300 g/L SeGUP、400 g/L GUP对PM达到了极敏效果，同一浓度下SeGUP比GUP抑菌圈大。抗生素药敏试验中CI的抑菌效果最佳，达到极敏。因此，选用抗生素CI进行体内外抑菌以及抑菌机制试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T001表1SeGUP、GUP对PM药敏的试验结果组别抑菌圈直径抗生素抑菌圈直径100 g/L SeGUP14.2恩诺沙星18.8100 g/L GUP12.3CI22.3200 g/L SeGUP16.6新霉素17.5200 g/L GUP14.3链霉素19.4300 g/L SeGUP22.2庆大霉素12.1300 g/L GUP18.7卡那霉素15.6400 g/L SeGUP25.0阿莫西林16.9400 g/L GUP21.3氨苄西林18.4mm2.1.2SeGUP、GUP、CI对PM的MIC结果（见表2）由表2可知，SeGUP对PM的MIC值为100.00 g/L，GUP对PM的MIC值为150.00 g/L，CI对PM的MIC值为0.04 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T002表2SeGUP、GUP、CI对PM的MIC结果组别SeGUPGUPCIMIC100.00150.000.04g/L2.1.3GUP、SeGUP对PM生长曲线的影响（见图1、图2）由图1、图2可知，PM在10 h之前完成了迟缓期和对数期；在1 MIC GUP、1 MIC SeGUP的影响下，细菌不增殖；1/2 MIC GUP、1/2 MIC SeGUP均对细菌表现出抑制作用，PM的迟缓期和对数期生长特征消失。1/2 MIC SeGUP对PM的生长抑制作用停留在0.5之前， 1/2 MIC GUP对PM的生长抑制作用停留在0.6左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.F001图1GUP对PM生长曲线的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.F002图2SeGUP对PM生长曲线的影响2.1.4SeGUP、GUP联合CI对PM的FICI结果（见表3）由表3可知，SeGUP、GUP联合CI使用后MIC从100.00、150.00 g/L降低至25.00、50.00 g/L，CI MIC从0.04 g/L降低到0.01、0.005 g/L。SeGUP联合CI表现为协同作用，GUP联合CI表现为相加作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T003表3SeGUP、GUP联合CI对PM的FICI结果药品联合前MICCI联合GUP后MICCI联合SeGUP后MICFICI结论GUP150.0050.00—0.58相加SeGUP100.00—25.0000.38协同CI0.040.010.005——g/L2.2体内抑菌试验结果2.2.1人工感染小鼠80% MLD结果（见表4）攻毒4 h后，小鼠开始精神不振，蜷缩抱团在一起，双眼紧闭；30 h后小鼠被毛粗糙，饮水饮食减少，尾部被毛凌乱、发黄，部分出现粪便稀薄情况；40 h后，小鼠毛发凌乱打结，不思饮食饮水，尾部血管开始发青，部分小鼠腹泻严重，小鼠开始出现死亡；3 d后小鼠继续死亡，部分小鼠尾部严重发青，不愿活动，也有部分小鼠开始恢复饮食饮水，逐渐恢复精神状态；4 d后未死亡小鼠开始恢复精神状态，开始攀爬，自由饮水饮食。由表4可知，对照组小鼠攻毒剂量为0，死亡率也为0。验证组小鼠腹腔注射5×106 CFU/mL菌液，4 d内小鼠死亡率仍为80%，最终确定小鼠80% MLD为5×106 CFU/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T004表4人工感染小鼠80% MLD结果项目菌液水平/(CFU/mL)05×1081×1085×1071×1075×1061×106死亡率0100100100908060%2.2.2各剂量CI对小鼠死亡率的影响（见表5）由表5可知，随着CI剂量增加，小鼠死亡率越低，预防效果越好，最佳预防剂量为7 mg/kg。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T005表5各剂量CI对小鼠死亡率的影响项目2 mg/kg3 mg/kg4 mg/kg5 mg/kg6 mg/kg7 mg/kg死亡率80704030200%2.2.3SeGUP、GUP体内抑菌试验（见表6）由表6可知，SeGUP高、中、低剂量组，GUP高、中剂量组死亡率极显著低于模型组（P0.01）；GUP低剂量组对小鼠死亡率无影响。同浓度下SeGUP剂量组死亡率低于GUP剂量组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T006表6SeGUP、GUP体内抑菌试验组别剂量/mL死亡率/%对照组0.30模型组0.3100CI组0.30SeGUP高剂量组0.340#SeGUP中剂量组0.360#SeGUP低剂量组0.380#GUP高剂量组0.360#GUP中剂量组0.370#GUP低剂量组0.390注：与模型组相比，“#”表示差异极显著（P0.01）。2.3抑菌机制结果2.3.1SeGUP、GUP联合CI对PM AKP、β-gal、DNA、蛋白质含量的影响（见表7）以12 h时MIC剂量组与对照组进行组间差异性比较；以12 h时1/2 MIC剂量组与对照组进行组间差异性比较。由表7可知，1/2 MIC SeGUP组、MIC SeGUP组PM培养液中AKP、β-gal、蛋白含量极显著高于对应的1/2 MIC GUP、MIC GUP组比（P0.01）；1/2 MIC SeGUP组、MIC SeGUP组PM培养液中AKP、β-gal、蛋白含量极显著低于对应的1/2 MIC CI组、MIC CI组（P0.01）；1/2 MIC（SeGUP+CI）组、MIC（SeGUP+CI）组PM培养液中AKP、β-gal、蛋白含量极显著高于对应的1/2 MIC（GUP+CI）、MIC（GUP+CI）组（P0.01）。1/2 MIC SeGUP组、MIC SeGUP组PM菌体内DNA浓度极显著低于对应的1/2 MIC GUP、MIC GUP组（P0.01）；MIC CI组PM菌体内DNA浓度极显著低于MIC SeGUP组（P0.01）；1/2 MIC（SeGUP+CI）组、MIC（SeGUP+CI）组PM菌体内DNA浓度极显著低于对应的1/2 MIC（GUP+CI）组、MIC（GUP+CI）组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T007表7SeGUP、GUP联合CI对PM AKP、β-gal、DNA、蛋白质含量的影响组别时间/hAKP/(ng/L)β-gal/(ng/L)DNA/(mg/L)蛋白质/(mg/L)MIC SeGUP组480.57±0.5024.53±0.44176.38±1.16206.51±0.5212298.70±1.29C70.92±0.29D49.38±0.08C516.63±0.26DMIC GUP组471.56±0.4820.55±0.44183.43±1.11199.14±1.3312278.33±0.72D64.52±0.47E52.62±1.23B506.35±0.29EMIC CI组486.44±0.4928.17±0.04168.53±1.03214.58±0.5212305.89±1.52B79.92±0.31C46.17±0.08D524.38±0.87CMIC（SeGUP+CI）组496.44±0.3731.88±1.60156.15±1.35228.66±0.0312312.38±1.11A86.67±0.41A40.32±0.32F536.21±0.39AMIC（GUP+CI）组492.91±0.0531.20±0.78162.19±0.16221.99±0.8612307.37±0.85B83.47±0.51B43.62±0.37E531.84±0.52BMIC对照组422.55±0.475.63±0.34274.56±1.7140.37±0.561260.25±1.00E11.29±0.31F236.21±0.20A70.19±0.74F1/2 MIC SeGUP组456.42±0.4414.58±0.51216.41±0.16146.81±1.4112145.45±0.64D33.02±0.85D84.74±0.38C264.04±0.45D1/2 MIC GUP组445.61±0.3311.97±0.12224.45±0.21140.26±0.3212137.41±1.03E28.82±0.22E92.57±0.04B256.08±0.37E1/2 MIC CI组460.44±0.3418.55±0.48214.31±5.83154.93±0.2112154.45±0.90C36.41±0.25C84.31±0.64C267.42±0.57C1/2 MIC（SeGUP+CI）组464.72±0.3220.80±0.39197.83±0.35178.64±0.3512160.33±1.15A39.77±0.28A65.83±0.15E283.61±0.15A1/2 MIC（GUP+CI）组460.56±0.5018.82±0.71203.88±2.45171.82±0.3712156.64±0.31B37.44±0.28B70.65±0.09D276.75±0.35BMIC对照组422.55±0.475.63±0.34274.56±1.7140.37±0.561260.25±1.00F11.29±0.31F236.21±0.20A70.19±0.74F注：同列相同时间数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表8与此同。2.3.2SeGUP、GUP联合CI对PM生物膜形成的影响（见图3）由图3可知，与1/2 MIC GUP、MIC GUP组比，1/2 MIC SeGUP组、MIC SeGUP组PM生物膜形成极显著减少（P0.01）；与1/2 MIC SeGUP、MIC SeGUP组比，1/2 MIC CI组、MIC CI组PM生物膜形成极显著减少（P0.01）；与1/2 MIC（GUP+CI）组、MIC（GUP+CI）组比，1/2 MIC（SeGUP+CI）组、MIC（SeGUP+CI）组PM生物膜形成极显著减少（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.F003图3SeGUP、GUP联合CI对PM生物膜形成的影响注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01）。2.3.3SeGUP、GUP联合CI对PM CAT、SOD活性的影响（见表8）由表8可知，1/2 MIC SeGUP组、MIC SeGUP组CAT、SOD活性极显著低于对应的1/2 MIC GUP组、MIC GUP组（P0.01）；1/2 MIC CI、MIC CI组CAT、SOD活性极显著低于对应的1/2 MIC SeGUP组、MIC SeGUP组（P0.01）；1/2 MIC（SeGUP+CI）组、MIC（SeGUP+CI）组CAT、SOD活性极显著低于对应的1/2 MIC（GUP+CI）、MIC（GUP+CI）组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.014.T008表8SeGUP、GUP联合CI对PM CAT、SOD活性的影响组别时间/hCAT/[nmol/(min·mL)]SOD/(U/mL)组别时间/hCAT/[nmol/(min·mL)]SOD/(U/mL)MIC SeGUP组412.564 3±0.025 01.766 3±0.011 01/2 MIC SeGUP组44.302 0±0.005 30.892 7±0.003 1125.110 0±0.050 0B0.613 8±0.001 5B123.150 0±0.010 0B0.323 7±0.004 2BMIC GUP组411.202 0±0.005 31.648 7±0.009 51/2 MIC GUP组44.034 3±0.014 60.785 7±0.003 1125.653 3±0.051 3A0.694 3±0.003 5A123.620 0±0.017 3A0.364 3±0.003 5AMIC CI组412.700 0±0.007 61.802 3±0.008 21/2 MIC CI组44.611 0±0.007 00.894 7±0.002 1124.933 3±0.066 6C0.562 7±0.003 8C122.820 0±0.045 9C0.303 0±0.002 0CMIC（SeGUP+CI）组413.952 0±0.049 11.867 7±0.010 31/2 MIC（SeGUP+CI）组46.338 7±0.001 50.944 7±0.004 2124.056 7±0.055 1E0.461 3±0.001 5E122.140 0±0.020 0E0.216 0±0.002 7EMIC（GUP+CI）组413.489 3±0.007 51.810 0±0.008 71/2 MIC（GUP+CI）组46.033 3±0.005 00.907 7±0.006 1124.606 7±0.083 9D0.522 0±0.001 0D122.360 0±0.020 0D0.265 3±0.001 5DMIC对照组43.070 0±0.017 30.268 3±0.003 1MIC对照组43.070 0±0.017 30.268 3±0.003 1122.000 0±0.120 0F0.200 7±0.002 5F122.000 0±0.120 0F0.200 7±0.002 5F3讨论3.1SeGUP、GUP对PM体内外抑菌效果的影响SeGUP、GUP对大肠杆菌肺炎克雷伯菌均具有较好体外抑菌作用，抑菌圈均为11 mm[4-5]。本试验中，SeGUP、GUP对PM均有较好的体外抑菌效果。随着浓度增高，抑菌圈扩大；SeGUP MIC小于GUP MIC，且SeGUP抑制PM增殖效果优于GUP。茯苓多糖与恩诺沙星联合同时降低了多糖与抗生素使用量[15]。山苍子精油联合四环素和土霉素表现为协同和相加作用，有效降低抗生素使用量[12]。经过前期试验筛选出对SeGUP、GUP均极敏的CI进行研究，发现SeGUP联合CI时表现为协同，GUP表现为相加，表明SeGUP能够更有效地降低CI使用量，为指导抗生素在生产实践中的使用、减缓PM抗生素耐药性以及SeGUP、GUP在临床中的应用提供了参考。高艳等[16]在小鼠体内建立多杀性巴氏杆菌模型，使用菪可轮蒲水煎液对小鼠进行预防和治疗干预，发现菪可轮蒲水煎液预防作用能够更有效地降低小鼠死亡率。探索PM对小鼠死亡率剂量的影响，在体内抑菌试验之前，先进行预试验能够大大提高本试验的成功率；随着SeGUP、GUP剂量增加，有效降低了小鼠死亡率；同等剂量的SeGUP预防效果优于GUP。结合体外抑菌试验，发现SeGUP、GUP体内外均有抑菌效果，这为甘草以及多糖类在畜牧业生产实践中的应用提供了参考，增加了SeGUP、GUP作为抗菌剂的可行性。3.2SeGUP、GUP、CI以及多糖联合CI对PM膜结构的影响AKP是存在于细胞壁与细胞膜之间的物质，当胞外AKP活性升高，说明细胞壁受到损伤。因此，AKP活性常用于指示细胞壁通透性。β-gal是胞内酶，可分解胞内乳糖，除细胞膜受损外，β-gal不会从胞内泄漏到胞外，细胞质内容物外漏是细胞膜受损的典型特征[17]。菌体内DNA浓度、胞外蛋白浓度反映细菌细胞膜完整性。本试验中，SeGUP、GUP对细菌细胞壁、细胞膜均具有破坏作用，SeGUP对细菌的破坏能力强于GUP；当SeGUP、GUP联合CI时，加大了对细菌细胞壁、细胞膜的破坏程度，增强了抗生素的杀菌效果。槲皮素能够破坏大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞壁和细胞膜，使胞外AKP、β-gal以及可溶性蛋白显著升高；槲皮素作为饲料添加剂具有代替抗生素的潜力[18]，与本试验结果一致。生物膜可分泌胞外多糖、蛋白质、脂质等物质，组成胞外聚合物（EPS），通过EPS包围细菌，生物膜之间相互附着，难以去除生物膜成为细菌耐药性原因之一。山苍子精油联合四环素和土霉素能够有效去除副溶血链球菌生物膜，减少了去除生物膜所需抗生素用量以及副溶血链球菌的耐药性[12]。SeGUP联合CI比GUP联合CI更能够抑制PM生物膜形成，呈剂量依赖趋势，有效降低CI的使用量。3.3SeGUP、GUP、CI以及多糖联合CI对PM抗氧化酶活性的影响SOD、CAT是细菌免受氧自由基侵害的酶；SOD通过催化超氧阴离子发生歧化作用生成H2O2、O2，CAT则促进H2O2分解，二者发挥协同作用可以保护细菌免受氧自由基的损害。当细菌处于不利环境时，机体受到氧自由基损害，细菌抗氧化系统被激活，通过消除活性氧以及减轻脂质过氧化损伤，维持细菌自身氧化-抗氧化系统动态平衡，达到生存目的[19-20]。抗生素导致细菌产生过量的活性氧，成为介导细菌死亡的机制之一。SeGUP、GUP、CI能够破坏PM机体氧化-抗氧化动态平衡，导致菌体处于氧化应激状态，破坏PM脂质、大分子物质、抑制PM生长。本试验中，4 h时，SeGUP、GUP、CI引起PM强烈氧化应激反应，SeGUP联合CI比GUP联合CI引起PM氧化应激反应更强烈，CAT、SOD活性更高；12 h时，各剂量组有效破坏PM抗氧化酶系统，降低SOD、CAT活性，其中1/2 MIC（SeGUP+CI）组、MIC（SeGUP+CI）组CAT、SOD活性最低，说明SeGUP联合CI对PM抗氧化酶抑制程度最强，导致活性氧的产生速度远大于分解速度，有效降低CI的使用量、达到抑菌效果。水稻提取物对铜绿假单胞菌的抑菌机理表明，水稻提取物后期可抑制CAT、SOD活性，导致过量有毒的自由基与菌体反应，造成菌体死亡[19]，与本试验一致。Fe3+可以降低庆大霉素在大肠杆菌中的浓度，减少大肠杆菌的氧化应激[20]，与本试验结果相反。4结论体内外抑菌、抑菌机制试验表明，SeGUP、GUP均有较好的体内外抑菌效果。SeGUP、GUP能够破坏PM膜结构、降低PM抗氧化酶活性，有效降低CI的使用量。SeGUP体内外抑菌、抑制PM机制效果均优于GUP。