奶牛乳腺炎主要是一种由病原微生物感染引起的乳腺组织的炎症反应，可导致牛奶产量和质量下降。近年来，奶牛隐性乳腺炎的发病率越来越高，使养殖业造成了经济损失[1]。临床治疗奶牛乳腺炎主要依赖抗生素，在早期取得了良好的治疗效果，但随着用药时间延长，导致病原菌广泛产生耐药性，且药物残留问题会危害人类和动物的健康[2]。此外，疫苗对乳腺炎的预防效果并不理想，也对该病的防治提出了更高要求[3]。因此，需要寻找和开发治疗奶牛乳腺炎新的有效药物。研究表明，炎症细胞在乳腺组织聚集并分泌促炎细胞因子，是乳腺炎发生的先决条件[4-5]。诸多研究表明，激活的有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核转录因子-κB（NF-κB）信号通路可通过促进白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-8（IL-8）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等释放介导炎症反应，且抑制MAPK和NF-κB信号通路可显著缓解脂多糖（LPS）诱导的小鼠乳腺炎[6]。此外，含NLR家族Pyrin域蛋白3（NLRP3）炎性小体是最具特征性的炎症体，与炎症反应密切相关，可促进IL-1β和IL-18成熟[7]。因此，调节NF-κB、MAPK和NLRP3信号通路可能是治疗奶牛乳腺炎的有效策略。中药治疗奶牛乳腺炎具有不易产生耐药性、低残留、毒副作用小等优势[8]。本研究所用自拟中药方由黄芪、金银花、蒲公英等14味中药组成，经课题组前期试验证明可治愈奶牛隐性乳腺炎（治愈率为63.38%，有效率为93.33%），增加产奶量[9]，但其抗炎机制尚未阐明。基于此，本研究旨在探究该中药组方的抗乳腺炎的分子机制，以期为阐明该方剂的临床应用提供参考。1材料与方法1.1主要试剂及仪器IL-1β、IL-8和TNF-α ELISA检测试剂盒，购自武汉华美生物工程有限公司；兔抗牛NF-κB p65、Phospho-NF-κB p65、p38 MAPK、Phospho-p38 MAPK抗体，购自Cell Signaling Technology公司；兔抗牛β-actin抗体购自Abcam公司；兔抗牛ERK1/2、Phospho-ERK1/2、JNK1/2/3、Phospho- JNK1/2/3、NLRP3抗体，购自Affinity公司；HRP标记羊抗兔IgG购自天津三箭生物技术有限公司；ECL化学发光检测试剂盒购自苏州宇恒生物公司；RIPA组织裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自Beyotime公司。全自动活检穿刺枪购自美国Bard公司。1.2中药乳房灌注剂制备称取黄芪、金银花和蒲公英各30 g，大青叶、青皮、紫花地丁、王不留行、连翘、瓜蒌、赤芍、当归、乳香和通草各15 g，甘草10 g。按照本课题组在文献[9]中报道的方法制备，中药煎剂在旋转蒸发仪中浓缩至生药浓度为1 g/mL。1.3试验设计在张家口某规模化养殖场的泌乳期为200 d左右的经产荷斯坦奶牛（2~4胎）中，根据奶牛群改良报告（DHI）筛选出牛奶体细胞数（SCC）大于50万个/mL（乳房和乳汁均无肉眼可见变化），且加利福尼亚乳腺炎试验（CMT）检测阳性的奶牛12头，随机分为4组，每组3个重复，每个重复1头牛。乳房灌注剂低、中、高剂量组奶牛于每天挤奶并用酒精棉球消毒乳头后，每个乳区分别灌注10、20、40 mL自制中药乳房灌注剂，1次/d，连用7 d；阳性对照组奶牛的乳区在试验期间每天灌注40 mL灭菌ddH2O。另选取6头SCC小于20万个/mL，且CMT检测阴性的奶牛，随机分为2组：正常对照组奶牛的乳区在试验期间每天灌注40 mL灭菌ddH2O；药物对照组奶牛的乳区每天灌注40 mL中药乳房灌注剂。1.4样品采集1.4.1牛奶样品的采集和乳清的分离最后一次乳房灌注24 h后，使用75%酒精消毒乳区，并用灭菌毛巾擦干，弃去前三把奶，每个乳区用灭菌离心管收集10 mL；4 ℃、16 000 ×g离心30 min，弃去上层乳脂收集乳清。将每头牛4个乳区分离到的乳清混合，获得均质化样品，-80 ℃保存。1.4.2奶牛乳腺组织样品采集参考文献[10]方法采集乳腺组织，最后一次乳房灌注24 h后，各组奶牛乳房局部皮下用1%盐酸普鲁卡因浸润麻醉，用一次性灭菌组织取样活检针（14G×15 cm）采集乳腺组织（50~100 mg/头）。将每头奶牛的乳腺组织样品置冻存管中，液氮冷冻，-80 ℃保存。1.5测定指标及方法1.5.1促炎细胞因子水平取1.4.1中分离到的乳清样品，按ELISA试剂盒说明书操作检测各组奶牛乳清中IL-1β、IL-8和TNF-α含量。1.5.2炎症信号通路相关蛋白表达取奶牛乳腺组织（50 mg/头），加入200 μL RIPA组织裂解液，组织研磨仪匀浆后于4 ℃、12 000 ×g离心5 min，取上清。按常规方法将蛋白样品变性处理后进行SDS-PAGE（20 μg/孔）并转移至PVDF膜。PVDF蛋白膜用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后置于稀释（1∶1 000）的NF-κB p65、p-NF-κB p65、p38、p-p38、细胞外调节激酶（ERK1/2）、p-ERK1/2、Jun N-端激酶（JNK1/2/3）、p-JNK1/2/3、NLRP3和β-actin抗体中4 ℃孵育过夜。各蛋白表达量用Li-COR Biosciences系统成像，根据各Western blotting条带光密度值（IOD）分析其表达量。各蛋白磷酸化水平=磷酸化蛋白IOD/非磷酸化蛋白IOD(1)NLRP3表达量=NLRP3 IOD/β-actin IOD(2)1.6数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0软件采用单因素检验中的Tukey's检验进行分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1自拟中药方对牛乳中SCC、IL-1β、TNF-α含量的影响（见表1）由表1可知，正常对照组和药物对照组牛奶中SCC均低于20万个/mL，极显著低于阳性对照组（P0.01）。经乳房灌注治疗后，中剂量组牛乳SCC显著低于阳性对照组（P0.05），高剂量组则降至正常，表明该灌注剂对奶牛隐性乳腺炎疗效确实。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.005.T001表1自拟中药方对牛乳中SCC、IL-1β、TNF-α含量的影响组别SCC/(万个/mL)IL-1β/(ng/L)TNF-α/(ng/L)正常对照组15.42±4.36Bc197.59±16.27Bc101.15±7.81Bc药物对照组15.94±3.92Bc207.44±18.41Bc104.93±9.83Bc乳腺炎阳性对照组61.75±8.21Aa306.75±22.63Aa143.57±10.87Aa乳房灌注低剂量组59.57±5.73Aa309.56±27.56Aa132.22±11.09Aab乳房灌注中剂量组45.69±3.81ABb280.69±24.69ABb117.64±8.46ABb乳房灌注高剂量组21.52±2.93Bc253.69±22.01Bc104.03±7.08Bc注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。与正常对照组及药物对照组相比，患隐性乳腺炎奶牛乳清中IL-1β、TNF-α含量均极显著升高（P0.01）。高剂量中药乳房灌注降低了促炎细胞因子含量，极显著低于阳性对照组（P0.01）。结果表明，本研究制备的乳房灌注剂可抑制隐性乳腺炎病牛乳清中促炎因子含量。2.2自拟中药方对乳腺组织中NF-κB和MAPK信号通路的影响（见表2）由表2可知，与正常对照组相比，患隐性乳腺炎奶牛的乳房组织中NF-κB p65和p38的磷酸化水平极显著升高（P0.01），ERK和JNK的磷酸化水平极显著升高（P0.01）。与阳性对照组相比，中、高剂量中药乳房灌注剂治疗后降低或恢复了上述蛋白的磷酸化水平，以高剂量组效果最好，但与正常对照组相比差异不显著（P0.05）。结果表明，中药乳房灌注剂可抑制乳腺组织中NF-κB和MAPK信号通路的激活。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.10.005.T002表2自拟中药方对乳腺组织中NF-κB和MAPK信号通路的影响组别NF-κB p65磷酸化ERK磷酸化JNK磷酸化p38磷酸化NLRP3表达量正常对照组0.16±0.03B0.13±0.03C0.15±0.07B0.08±0.01Bc0.07±0.01B药物对照组0.18±0.02B0.11±0.02C0.11±0.03B0.04±0.01Bc0.08±0.01B乳腺炎阳性对照组0.66±0.09A1.05±0.11A0.94±0.22A0.35±0.03Aa0.26±0.03A乳房灌注低剂量组0.58±0.06A0.56±0.08B0.96±0.13A0.19±0.08ABb0.22±0.02A乳房灌注中剂量组0.57±0.04A0.28±0.06C0.68±0.10A0.11±0.04Bbc0.23±0.04A乳房灌注高剂量组0.27±0.05B0.11±0.02C0.20±0.05B0.08±0.01Bc0.12±0.02B此外，NLRP3的表达在炎症反应中发挥关键作用。与正常对照组及药物对照组相比，患隐性乳腺炎奶牛乳腺组织中NLRP3的表达极显著增加（P0.01），而中药乳房灌注剂治疗可显著抑制乳腺组织中NLRP3的表达。3讨论3.1自拟中药方的药理作用及其对牛乳SCC的影响奶牛乳腺炎尤其是隐性乳腺炎的发病率逐年升高，每年均会造成巨大的经济损失。抗生素一直是治疗奶牛乳腺炎的主要药物，但存在药物残留、新的耐药菌出现等副作用[11]。中药具有不易产生耐药性、无残留或低残留、毒副作用小等优势[8]。已有研究表明，黄芪[12]、蒲公英[13]、金银花[14]、瓜蒌[15]等具有抗菌消炎作用，可显著改善奶牛乳腺炎临床症状，增加产奶量，降低牛奶中SCC。本研究所用自拟中药方中的主药即为黄芪，具有益气补虚作用；配合蒲公英、连翘、金银花、紫花地丁、大青叶清热解毒、消肿；辅以赤芍、瓜蒌、通草等活血散瘀、活络通乳。现代药理学研究表明，虽然该方中药物多具有免疫调节、抗菌、抗炎等作用，但其抗炎机制尚未明确。因此，在课题组前期试验基础上，本研究进一步证明了使用该自拟中药方制备的乳房灌注剂显著降低了牛乳中SCC，表明其具有治疗奶牛隐性乳腺炎作用，并进一步探讨了其对乳腺炎症信号通路的调节作用。3.2自拟中药方对乳清炎性细胞因子分泌的作用TNF-α和IL-1β是典型的促炎细胞因子，介导炎症反应[16-17]。Qiu等[18]报道，乳腺炎性细胞浸润并分泌炎性细胞因子是乳腺炎主要的病理特征。但有研究表明，与临床型乳腺炎不同，患隐性乳腺炎奶牛的血清中IL-1β、TNF-α和IL-8等促炎细胞因子含量和正常奶牛并无差异[19]，而在乳清中升高，且与隐性乳腺炎发病的严重程度呈正相关[20]。因此，本研究通过检测奶牛乳清中TNF-α和IL-1β的含量评估了中药乳房灌注剂的抗炎作用，结果显示，隐性乳腺炎阳性奶牛乳清中TNF-α和IL-1β含量升高，中药灌注剂治疗后其水平恢复正常，提示该乳房灌注剂可抑制乳腺组织炎症反应。3.3自拟中药方对隐性乳腺炎奶牛乳腺组织MAPK/NF-κB和NLRP3信号通路的调节作用NF-κB是一种多亚基核转录因子，参与诸多免疫反应相关靶基因的转录调控，其中包括促炎细胞因子的基因[21]。此外，ERK、JNK和p38 MAPK家族亦参与调节细胞内的许多生理活动，在促炎细胞因子的分泌中发挥重要作用[22]。已有研究证实，革兰氏阴性菌的内毒素可与Toll样受体4（TLR4）结合，激活NF-κB和MAPK信号通路，进而引起小鼠乳腺组织炎症反应[23]。因此，本研究进一步探究了中药乳房灌注剂对奶牛乳腺组织中NF-κB和MAPK信号通路的作用，结果表明，该中药乳房灌注剂能够有效降低病牛乳腺组织中NF-κB、ERK、JNK和p38 MAPK的磷酸化水平，提示其抗炎作用可能与这些信号通路有关。炎症小体可启动组织对各种刺激的炎症反应，NLRP3炎症小体是迄今发现的研究最广泛的炎症体，可激活休眠的Pro-Caspase-1蛋白水解为活化的Caspase-1，从而将细胞因子前体Pro-IL-1β和Pro-IL-18分别转化为成熟的、具有生物活性的IL-1β和IL-18[24]。鉴于NLRP3在炎症过程中的重要作用，本研究进一步探究了NLRP3在隐性乳腺炎病牛乳腺组织中的表达，结果表明，中药乳房灌注剂显著抑制了NLRP3的表达。4结论本研究结果显示，自拟中药乳房灌注剂可能是通过抑制NF-κB、MAPK、NLRP3信号通路抑制了促炎细胞因子的分泌，而且不影响健康奶牛乳中SCC和乳清中IL-1β和TNF-α含量以及乳腺组织中上述炎症信号通路相关蛋白表达，表明该灌注剂是一种潜在的治疗奶牛隐性乳腺炎安全有效的药物，但其确切有效成分及其作用机制尚有待进一步研究。