早在1990年，Eberwine等[1]尝试进行单细胞转录组学试验。随着高通量测序技术的飞速发展，直到2017年，单细胞RNA测序scRNA-seq方法开始商业化。单细胞转录组测序是基于单细胞分辨率对全转录组进行扩增与测序的一种方法，有助于从更细微和更全面的角度剖析复杂生物系统中的细胞异质性和发育时间[2-3]，如对人类肿瘤细胞的分型和拟时间分析[4-5]。目前，对组织异质性的理解主要基于基因组学和转录组学，但这种测序数据代表的是数千到数百万个细胞基因组信息或基因表达模式的平均值，可能会掩盖细胞之间的生物学差异。单细胞转录组学可以对mRNA信息进行全面和定量解释，识别单个细胞，解决肿瘤组织异质性，揭示基因调控关系，追踪恶性转化的转录轨迹[6]。肠道是动物消化吸收营养物质的重要器官。维持肠道结构和功能对保障动物健康至关重要[7]。肠道微生物主要定植于黏液层，有益菌可通过增加黏液的产生和占据黏蛋白上可用的结合位点防止病原菌入侵，阻止病原菌在黏液层定植[8]。除微生物屏障外，化学屏障、物理屏障和免疫屏障与消化道的结构和功能直接相关。近几年，探究疾病对肠道屏障的影响、饲料中添加益生元和益生菌、采用粪菌移植等手段改变猪肠道屏障功能的相关研究较多。本文对常见的几种单细胞转录组测序技术、肠道屏障组成和单细胞转录组技术在动物肠道上的应用进行综述，以期为肠道健康的深入研究提供参考。1单细胞转录组测序技术单细胞转录组测序技术是近年的研究热点，被广泛应用于人类的细胞免疫、肿瘤、肠道疾病等方面[9-11]。目前，利用scRNA-seq方法的3种常用单细胞转录组测序技术分别是10×Genomics[12]、Smart-seq2[13]和Drop-Seq[14]，除Smart-seq2是基于微孔板的低通量方法外，其余2种属于基于凝胶珠（内含试剂和条形码）的高通量方法。这些方法的区别在于标记细胞转录本及生成的测序文库，测序流程见图1。10×Genomics平台支持唯一的分子标记以去除与PCR相关的测序偏差，测序深度更高，能够解决等位基因表达中与PCR、等位基因定位和测序深度造成的偏差等问题，每个样本细胞数可达5 000~10 000个[15]。通过10×Genomics的连续读数捕获的远程序列信息可以帮助解析基因组序列重复，产生准确和连续的基因组组装草图，提供相对低成本和直接的方法创建二倍体的从头组装[16]。Smart-seq2试验条件能够在分子生物学实验室中轻松优化，适用于许多不同的细胞类型。单细胞检测得到的转录本相较于其他方法更多，尽管测序量不如10×Genomics，但单细胞检测敏感度更高，检测到的表达基因数远高于10×Genomics[17]。Drop-Seq与10×Genomics的区别在于测序文库的构建。Drop-Seq标记PCR产物；10×Genomics是片段化PCR产物，参与文库构建库。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.033.F001图13种单细胞测序方法2肠道屏障组成及功能2.1微生物屏障肠道微生物构成的屏障对肠道的稳态和功能至关重要，能够通过与宿主肠道上皮和免疫系统的直接作用维持肠道内环境稳态[18]。肠腔和黏液层中的微生物是不同的微生态系统。肠腔中超过90%的微生物属于厚壁菌门和拟杆菌门；黏液层中微生物的数量和多样性较低，组成也不同[19]。肠道微生物将膳食纤维和抗性淀粉等代谢为短链脂肪酸。丁酸盐能够增加肠细胞的线粒体依赖性耗氧量，诱导参与保护肠道屏障功能缺氧诱导因子靶基因表达[20]。肠道中的树突状细胞（DC）接受抗原呈递促使IgA分泌。IgA除具有防御作用外，还能够与微生物结合，实现宿主-微生物共生[21]。脆弱拟杆菌能够通过改变自身表面结构与IgA交联实现在肠道的定植[22]。双歧杆菌在黏液层的定植由细胞外结构（菌毛和细胞外多糖）介导[23]。肠杆菌属通过鞭毛穿透黏液层定植于肠上皮细胞层[24]，诱导产生抗炎细胞因子白细胞介素-22（IL-22），减少促炎细胞因子白细胞介素-17（IL-17）的产生，发挥抗炎作用[25]。2.2化学屏障黏液层由杯状细胞合成的黏蛋白紧密黏附在上皮顶端形成化学屏障[26]，保护肠道上皮不受酸性环境的腐蚀。黏液层能够起到润滑作用，减少食物对肠道上皮的机械损伤[27]。黏蛋白能够作为机体内源性蛋白质的来源[28]。缺乏结肠黏蛋白-2（MUC 2）的小鼠更容易发展成严重的结肠炎，发生结肠癌，可能是肠上皮细胞直接暴露于肠腔细菌环境[29]。齿双歧杆菌功能与双歧杆菌类似，是一种肠道共生菌，对黏蛋白调节有益，具有改善肠道黏液层功能和治疗肠道疾病作用[30]。口服枯草芽孢杆菌能提高肠道中梭状芽孢杆菌属、乳杆菌属、弯曲杆菌属的相对丰度，通过上调Atoh1基因的表达增加杯状细胞数量，提高MUC 2的分泌量[31]。2.3物理屏障单层上皮细胞构成肠道的物理屏障，由紧密连接、间隙连接和桥粒等细胞间结构维持[32]。紧密连接由紧密连接蛋白网络组成，蛋白链间存在相互作用连接相邻细胞，防止大分子在细胞间穿行[33]。间隙连接为肠道的正常功能提供了细胞间通道，由来自相邻两个细胞的两个连接子半通道组成[34]。有研究以小鼠为试验动物，探究细菌性腹泻情况下小鼠结肠腔中水分变化，利用示踪分子研究未配对的连接子半通道的存在和功能，证明功能性连接子半通道是感染性腹泻期间肠道水分释放的分子机制[35]。桥粒的黏附力由连接到中间丝系统的桥粒钙黏蛋白介导，人类肠道主要表达Dsg2和Dsc2两种桥粒钙黏蛋白[36-37]。Dsg缺陷小鼠模型的桥粒超微结构发生改变，肠道通透性增加[38]。在仔猪日粮中补充芽孢杆菌能够改善肠黏膜结构、紧密连接和激活TLR（toll-like receptors）信号通路，提高肠上皮细胞屏障和免疫功能[39]。肠上皮细胞能够分化成吸收细胞、潘氏细胞、杯状细胞、肠内分泌细胞等[40]。此外，肠上皮能够通过微生物特定的分子模式来区分共生和致病微生物群，通过炎症反应响应病原体入侵[41]。2.4免疫屏障肠道固有层（LP）中分布着大量的淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞，能够发挥细胞介导和体液免疫功能，是维护肠道健康的免疫屏障[42]。鼠伤寒沙门氏菌穿过猪肠道的物理屏障与免疫系统的细胞接触，由单核细胞分化而来的巨噬细胞和DC细胞能够呈递抗原，诱导T细胞活化，激活相应的免疫应答[43]。4周龄仔猪肠道中CD4-CD8α+αγ T细胞和TCD4-CD8α+αβ T细胞百分比随日龄的增长而增加[44]。断奶后的仔猪易感2型猪圆环病毒，应用夹层免疫荧光技术检测注射/未注射疫苗的患病仔猪，发现注射疫苗组仔猪十二指肠到回肠固有层中，含抗2型猪圆环病毒抗体的浆细胞数量随时间推移而显著增加，表明肠道免疫反应对病原体起着重要的防御作用[45]。3scRNA-seq技术在肠道方面的应用3.1scRNA-seq技术在鼠肠道方面的应用免疫细胞在组织稳态中具有重要作用，利用Smart-seq2方法分析健康或寄生虫感染期间小鼠模型中肠干细胞（ISC）-T细胞的相互作用，确定了ISC-Ⅰ、ISC-Ⅱ和ISC-Ⅲ亚群，分析显示ISC-Ⅰ是主干，ISC-Ⅱ和ISC-Ⅲ逐渐分化。此外，类器官共培养系统证明关键炎症和调节性Th细胞通过影响Lgr5＋和ISC上MHCII的表达，影响Th细胞分化。因此，ISC的MHCII表达可能与其他黏膜或非黏膜组织中的Th细胞串扰，起类似响应促炎和抗炎信号的作用，ISC作为适应性免疫细胞调节实质干细胞维持组织稳态[46]。双特异性磷酸酶6（Dusp6）能够调节丝裂原活化蛋白激酶途径的负反馈过程，还能够参与某些免疫细胞的调节。应用10×Genomics平台测序分析Dusp6敲除的小鼠肠道白细胞的个体组成和转录改变，发现肠道DC细胞、CD8+ T细胞、ILC1细胞、ILC2细胞、ILC3细胞、B细胞和自然杀伤细胞（NK）数量降低。亚型水平的分析进一步表明Dusp6小鼠肠道免疫细胞更倾向于保持失活或未成熟状态。模式生物表型富集分析表明，Dusp6缺乏可能影响免疫细胞谱系的分化途径[47]。3.2scRNA-seq技术在猪肠道方面的应用scRNA-seq在猪肠道中的应用较少，其中主要使用的是10×Genomics平台。Meng等[48]利用10×Genomics平台探究0~21日龄仔猪回肠发育，分离出具有相关标记基因的13种细胞类型，包括干细胞、肠道干细胞（TA）、肠上皮祖细胞、早期肠上皮祖细胞、晚期肠上皮祖细胞、未成熟的肠上皮细胞、成熟的肠上皮细胞、肠内分泌细胞、潘氏细胞（Paneth）、杯状细胞和簇状细胞等。Paneth细胞数量只在0~1日龄短暂上升，随后逐渐减少。Li等[49]使用10×Genomics平台对人类、小鼠、大鼠、猕猴和猪的回肠组织进行scRNA-seq分析，猪回肠中鉴定出肠上皮细胞、TA细胞、杯状细胞、杯状祖细胞、干细胞、肠内分泌细胞、簇状细胞和CA7+等；除肠内分泌细胞、簇状细胞和CA7+细胞外，其余5种均是高度保守的细胞类型。因此，Paneth细胞仅在人类和小鼠回肠细胞中存在，在猕猴、大鼠和猪中不存在。猪肠道疾病方面还未见利用scRNA-seq技术。RNA-seq应用相对更普遍。使用RNA-seq技术揭示了生长迟缓（PGR）和健康仔猪空肠黏膜的转录组图谱。相比于健康仔猪，PGR仔猪关于营养代谢和免疫反应的差异表达基因下调[50]。猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）主要感染仔猪小肠，仔猪肠道屏障功被破坏，导致仔猪呕吐和严重腹泻，仔猪死亡率接近100%[51]。有研究对SADS-CoV感染的肠上皮细胞进行RNA-seq分析，结果表明，SADS-CoV改变了宿主细胞的基因表达模式，包括免疫反应、信号和细胞因子转导及抗病毒反应[52]。猪流行性腹泻病毒（PEDV）具有急性传染性。应用RNA-seq技术对病毒感染的细胞进行测序，发现核糖体蛋白和氧化磷酸化过程广泛参与了PEDV感染引起的宿主细胞的病理变化和调控，但未阐明具体机制[53]。猪三角冠状病毒（PDCoV）是一种新兴的猪肠道致病性冠状病毒，能够导致仔猪急性水样腹泻和呕吐。RNA-seq结果表明，PDCoV激活NF-kB信号通路，促进炎症因子的表达[54]。尽管RNA-seq能够反映受感染细胞的整体基因表达谱，但不能反映细胞异质性。有研究使用产肠毒素的大肠杆菌攻击细菌胞外多糖预处理后的猪肠上皮细胞，RNA-seq分析结果显示，细胞对产肠毒素大肠杆菌感染的反应不同[55]。有研究基于对受隐孢子虫感染和未感染的猪肠上皮细胞的RNA-seq进行分析，结果表明隐孢子虫感染对宿主基因表达有显著影响，最高差异表达水平的基因被上调或下调约6倍。因此，在单个细胞中的差异表达可能是10倍或更高[56]。参与细胞增殖的基因在受感染的细胞中上调，RNA-seq技术的分辨率难以满足对单个细胞内的转录水平变化，scRNA-seq可能是提高转录组分析分辨率的可行方法。3.3scRNA-seq技术在鸡肠道方面的应用鸡肠道利用scRNA-seq技术的相关研究还未见报道。目前，利用10×Genomics平台测序分析传染性法氏囊病毒由鼻腔进入机体感染的途径，确定主要靶细胞类型[57]。10×Genomics平台测序鉴定出骨骼肌发育过程中肌细胞和脂肪细胞簇数量，获得脂肪细胞标记基因[58]。10×Genomics平台测序获得感染禽白血病病毒J亚群和感染后21 d的鸡外周血单核细胞（PBMC）亚群和分子标记[59]。利用Smart-Seq2方法表征感染禽白血病病毒J亚群感染后的鸡的PBMC中CD8＋T受体的细胞异质性和转录差异[60]。3.4scRNA-seq技术在反刍动物肠道方面的应用牛和羊肠道利用scRNA-seq技术的相关研究还未见报道。Gao等[61]利用10×Genomics平台获得断奶前后的荷斯坦牛瘤胃上皮组织的scRNA-seq数据，描述了细胞周期、细胞类型、拟时序分析、调控网络和共表达基因的功能模式，但获得的瘤胃细胞的发育模型还需要通过更多重复和功能验证来进一步测试和改进。scRNA-seq技术揭示了山羊卵巢卵泡颗粒细胞在不同阶段的基因表达模式[62]，卵母细胞成熟过程中mRNA的动态变化[63]，奶山羊、绵羊的精子发生过程涉及的信号通路，候选标记基因和细胞分型等[64-65]。4结论scRNA-seq技术已被应用于猪肠道细胞分型，但在鸡和反刍动物肠道方面的应用未见报道。利用scRNA-seq技术能够完成肠组织的细胞分型及标记基因的挑选。scRNA-seq技术有助于进一步揭示机体单个细胞水平的基因表达模式、特定细胞亚群的分析、拟时分析及调控网络分析，对寻找肠道免疫中潜在的分子机制及作用靶点有推动作用。