微生态制剂能够调节动物肠道的微生物菌群平衡，提高肠道对营养物质的利用率，具有低残留、无污染的优点[1-2]。复合微生态制剂是由多种益生菌组成的复合物[3]。玉屏风多糖为玉屏风散中提取的活性成分，兼具黄芪多糖、白术多糖和防风多糖的生物活性[4]，可促进动物生长、增强机体免疫力、提高抗氧化功能[5]。微生态制剂与中草药、酶制剂、寡糖结合使用可以提高饲料转化率，增强动物机体免疫力，促进动物生长发育[6-7]。两者联合使用效果比单一效果好[8-9]。2019年，我国草鱼养殖产量为553.31 t，居全国淡水养殖鱼类产量之首[10]。添加适量益生菌可改善水质及水产动物的肠道健康。本试验在草鱼的养殖水体中添加玉屏风多糖复合微生态制剂，分析复合微生态制剂对草鱼生长性能和肠道菌群结构的影响，以期为草鱼健康养殖提供参考。1材料与方法1.1试验材料复合微生态制剂中的光合细菌、枯草芽孢杆菌、副干酪乳酸杆菌、屎肠球菌按2∶1∶2∶2混合，有效菌量为3×108 CUF/mL。玉屏风多糖复合微生态制剂的复微生态制剂、玉屏风多糖按质量比1∶1混合。玉屏风多糖中总糖、总蛋白含量分别为28.980、0.141 g/L，购自（佛山）德众药业有限公司。试验草鱼饵料购自南宁通威饲料有限公司，其营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.T001表1基础饵料营养水平项目水分粗蛋白水解脂肪粗灰分粗纤维粗盐分钙磷含量8.3244.799.7811.003.681.302.211.63%1.2试验设计及饲养管理试验在佛山科技学院养殖基地进行。挑选360尾试验鱼随机分配至9个养殖桶（长70 cm、宽50 cm、高60 cm、水深30 L），分成3组，每组3个重复（即3桶），每个重复40尾鱼。预试验7 d，正式试验期21 d。试验期间24 h充氧，水温为（28.0±0.5)℃。每日8：00、16：00投喂2次，每日投喂量为整体草鱼重量的1%~3%，根据摄食情况适度调整投喂量，投喂饵料0.5 h后清除剩余饵料。每日早晚对养殖桶吸底，更换1/3的养殖水体。更换的水为消毒曝气、温度相同的自来水。换水后分别在B组桶、C组桶内加入3 mL/m3的复合微生态制剂、玉屏风多糖复合微生态制剂。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验第21 d，草鱼饥饿处理24 h，处死。每桶选取3尾草鱼称重、测量体长，计算增重率、特定生长率、存活率、肥满度、肝体比、脏体比、饵料系数。增重率=(末重-初重)/重×100%(1)特定生长率=(1n末重-1n初重)/饲养时间×100%(2)存活率=末期鱼数量/初始鱼数量×100%(3)肥满度＝体重/体长3×100(4)肝体比＝肝胰体重/每尾末体重×100%(5)脏体比＝内脏体重/每尾末体重×100%(6)饵料系数＝饵料投饲量/鱼体增重量(7)1.3.2肠道消化酶活性、组织形态及微生物群落组成试验第14 d，投喂饵料６ h后，取草鱼的肠道内容物混样放入无菌EP管中，转至液氮罐速冻，-80 ℃保藏。北京诺禾致源生物信息科技有限公司采用高通量测序，分析肠道菌群的丰富度及多样性。在试验第21 d，取草鱼肠道放入4%多聚甲醛保存液中，制成肠道切片；取肠道中内容物分析肠道消化酶活性，草鱼肠道内容物处理与第14 d相同。相关试剂盒购于上海生工有限公司，具体操作参考说明书。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2016软件进行统计，SPSS 19.0进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼生长性能的影响（见表2）由表2可知，C组草鱼末重、增重率均显著高于对照组（P0.05）。各组草鱼肝体比、胰体比、肥满度、存活率差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.T002表2玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼生长性能的影响组别初重/g末重/g增重率/％特定生长率/(％/d)肝体比/％脏体比/％肥满度/（g/cm3）饵料系数存活率/％A组8.02±0.1213.70±0.35a0.70±0.00a2.54±0.00a1.45±0.062.92±0.051.10±0.101.40±0.0898B组8.02±0.1314.31±0.26a0.78±0.00a2.75±0.00a1.48±0.023.02±0.101.15±0.141.42±0.0598C组8.02±0.1115.68±0.42b0.95±0.51b3.19±0.00ab1.50±0.023.13±0.071.14±0.901.44±0.03100注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道消化酶活性的影响（见表3）由表3可知，C组草鱼肠道淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.T003表3玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道消化酶活性的影响组别淀粉酶脂肪酶胰蛋白酶A组2.32±0.38a7.43±0.18a197.00±12.32aB组4.59±0.62ab18.26±1.41b280.90±18.97abC组5.64±0.85b19.57±0.86b345.50±32.63bU/mg prot2.3玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道组织形态的影响（见表4、图1）由表4可知，草鱼肠道绒毛高度由高到低依次为对照组C组B组，肠道隐窝深度由高到低依次为对照组B组C组；B组、C组草鱼肠道肌层厚度均显著高于对照组（P0.05），分别提高了14.37%、23.61%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.T004表4玉屏风多糖复合微生态制剂草鱼肠道组织形态的影响组别绒毛高度隐窝深度肌层厚度A组267.58±28.71b216.15±23.99b35.27±1.08aB组232.60±30.65a200.35±19.58ab40.34±1.35bC组258.42±16.53b184.76±13.46a43.66±0.86bμm由图1可知，玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道的绒毛高度和肌层厚度具有一定的改善作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.F001图1草鱼中肠组织病理切片2.4玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道微生物群落Alpha多样性指数的影响（见表5、表6）由表5、表6可知，第14 d，草鱼肠道样品通过测序和Barcode辨识得112 120条肠道样品序列，平均产生12 458条序列。第28 d，共获得112 073条肠道样品序列，平均产生12 453条序列。Ace指数、Chao指数、Shannon指数、Simpson指数反映草鱼肠道菌群的Alpha多样性。第14 d，B组草鱼肠道物种多样性指数最大；第21 d，试验C组草鱼肠道物种多样性指数最大，Shannon指数、Simpson指数与对照组、B组相比差异均不显著（P0.05）。研究表明，试验C组草鱼肠道物种多样性随着时间延长而增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.T005表5第14 d肠道微生物群落Alpha多样性指数组别序列数总分类单元数Shannon指数Simpson指数Chao指数覆盖率/%A组37 025±1 164943.67±0.50ab0.76±0.14a104.80±11.33a99.780±0.010B组35 198±8011444.35±0.32b0.87±0.06b151.95±4.17b99.790±0.001C组36 625±505932.95±0.73a0.72±0.09a114.25±9.78a99.780±0.00110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.T006表6第21 d肠道微生物群落Alpha多样性指数组别序列数总分类单元数Shannon指数Simpson指数Chao指数覆盖率/%A组37 025±9391353.30±0.14ab0.74±0.19157.50±7.85b99.690±0.001B组38 442±6151102.90±0.64a0.74±0.08134.00±22.77a99.670±0.001C组34 150±8751283.60±1.23b0.74±0.31149.00±24.55b99.610±0.0012.5玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道微生物组成影响（见图2、图3）由图2可知，3组草鱼肠道微生物菌落为13个门。第14 d，3组草鱼肠道中优势菌门分别为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）；对照组草鱼肠道中变形菌门、厚壁菌门丰富度占比分别为84.15%、6.70%；B组分别为71.23%、14.47%；C组分别为58.62%、27.42%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.F002图2第14 d、第21 d肠道微生物在门水平上的相对丰度第21 d，对照组草鱼肠道中变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）丰富度占比分别为67.76%、28.61%；B组分别为44.42%、45.83%；C组分别为81.22%、12.52%。第14~21 d草鱼肠道中菌群在门水平上相对丰度变化为变形菌门数目下降，厚壁菌门数目上升。由图3可知，草鱼肠道优势菌属分别为宝石杆菌属（Gemmabacter）、厌氧菌属(Anaerorhabdus furcosa groups）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.014.F003图3第14 d、第21 d肠道微生物在属水平上的相对丰度第14 d，对照组、B组、C组草鱼肠道宝石杆菌属占比分别为3.58%、10.35%、28.19%。第21 d，对照组、B组、C组草鱼肠道宝石杆菌属（Gemmabacter）占比分别为28.67%、26.82%、17.33%。第14 d，C组草鱼肠道特有的Anemone flaccida丰度占比为19.55%；第21 d，对照组草鱼肠道中Paucibacter及C组Shewanella丰度占比分别为24.61%、37.87%。3讨论3.1玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼生长性能的影响复合微生态制剂含有大量的营养物质，供给养殖动物肠道蛋白质、维生素等，促进养殖动物生长发育。张冬梅等[11]在鲈鱼基础饵料中添加0.5%、1.0%的枯草芽孢杆菌，发现能够提高鲈鱼增重率、特定生长率。王志敬等[12]在草鱼饵料中添加0.8~2.0 g/kg玉屏风多糖，发现提高了草鱼增重率和特定生长率，降低了饵料系数。本试验结果显示，复合微生态制可提高草鱼特定生长率、增重率、末重，且复合微生态制剂与多糖联合的使用效果优于单一使用。3.2玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道消化酶活性的影响消化酶活性影响肠道中营养物质的消化吸收[13]。有研究表明，在饵料中加入枯草芽孢杆菌[14]、乳酸菌[15]、酵母菌[16]可明显提高养殖动物肠道消化酶活性。曾圣等[17]研究发现，EＭ菌饵料可提高杂交鲟鱼肠道中胰蛋白酶、胃蛋白酶、淀粉酶及脂肪酶活性。本试验结果显示，在养殖水体中添加玉屏风复合微生态制剂可提高草鱼肠道中淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶活性。结果表明，玉屏风复合微生态制剂对草鱼肠道中营养物质的吸收起促进作用。3.3玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道组织结构的影响水环境和食物影响养殖动物肠道菌群结构[18-19]。肠绒毛高度、数量及形态结构影响肠道消化和吸收营养物质的能力[20]。肌层厚度影响营养物质的吸收和转运速度[21-22]。本试验结果显示，复合微生态制剂、玉屏风复合微生态制剂能够降低草鱼肠道隐窝深度，增加肌层厚度。有研究发现，在草鱼[23-24]、长吻鮠[25]、南亚野鲮[26]等饵料中添加复合益生菌、玉屏风复合益生菌制剂，增加了养殖动物肠道的绒毛高度，提高了肌层厚度，降低了隐窝深度，结果与本研究结论一致。宿主肠道组织结构与微生物分泌的次生代谢产物相关[27]。本试验结果显示，玉屏风复合微生态制剂对草鱼肠道组织结构具有改善作用，原因可能是玉屏风复合微生态制剂的一些活性物质对草鱼肠道黏膜细胞具有促进作用，但其作用机制还需进一步研究。3.4玉屏风多糖复合微生态制剂对草鱼肠道菌群的影响益生菌通过定植在养殖动物肠道，调控细胞免疫和体液免疫[28]。肠道微生态稳定是维护养殖动物物质代谢、免疫调节功能的关键因素[29]。变形菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和梭杆菌门是淡水鱼类肠道菌群中优势菌门[30]，在养殖动物中优势菌门为变形菌门和拟杆菌门[31]。本试验中，草鱼肠道中的优势菌门为变形菌门和厚壁菌门，优势菌群属为宝石杆菌属和厌氧菌属。王颖等[32]在草鱼养殖饵料中加入2%的微生态制剂组，发现草鱼肠道优势菌属发生了改变。本试验中，在养殖水体中添加玉屏风复合微生态制剂，草鱼肠道菌群多样性和丰度随着时间延长逐渐升高。结果表明，在水体中添加玉屏风多糖复合微生态制剂后能够改善草鱼肠道微生物平衡，提高草鱼生长性能、肠道消化酶活性。4结论本研究结果表明，在草鱼养殖水体中添加复玉屏风多糖复合微生态制剂可促进草鱼生长发育，提高草鱼肠道内消化酶的活性，促进营养物质的消化吸收，改善肠道细菌群落结构，优化草鱼肠道内环境。