全缘金粟兰（Chloranthus holostegius）为苗药佳九留的主要原料，药用部位为根[1]，又名四块瓦，主要产自贵州、广西、云南等地区，多生长在山坡密林下或灌木丛中。全缘金粟兰在苗药学中归为治伤药，性热、属冷经；味素质为麻、苦；走中、里两关，入身架，具有抗炎，消肿止痛的功效[2]，具有悠久的用药历史和丰富的用药经验，并且全缘金素兰还应用于治疗牛骨折[3]以及牛肩胛部软组织损伤引起的肩跛行[4]。中草药作为饲料添加剂具有绿色、安全的特点，特别是其具有的清除氧自由基、抗炎以及促进生长等功效，在禽畜饲养过程中具有重要作用[5-8]。氧化应激容易引起种畜发病率增加和繁殖障碍，影响动物生长性能，导致禽畜肉品质下降[9-10]。黄酮类化合物是一类具有丰富生理活性的天然产物，抗氧化及清除自由基的能力较强[11-14]。前期研究发现，该药材富含黄酮类化合物，但是目前全缘金粟兰在不同地区使用的药用部位不尽相同，贵州地区习用根[15]，云南省使用全草[16]，广西地区使用根或根茎。因此，本试验通过优化全缘金粟兰总黄酮的提取工艺，对比其地上与地下总黄酮在不同浓度下体外抗氧化能力，挖掘全缘金粟兰在畜禽饲养过程中抗氧化应激的潜力，为全缘金粟兰不同用药部位的合理开发与利用提供依据。1材料与方法1.1材料与试剂全缘金粟兰采挖于贵州省黔西南布依族苗族自治州。芦丁标准品购自贵州华夏高科科技有限公司，甲醇、乙醇购自成都市科龙化工试剂厂，亚硝酸钠、硝酸铝、氯化铁、氢氧化钠、DPPH、水杨酸购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，试验用水为蒸馏水。1.2仪器设备电子天平（梅特勒托利多仪器集团）、数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司）、UV-1800紫外—可见光分光光度计（日本岛津公司）。1.3标准曲线绘制参照《中国药典》使用亚硝酸钠—硝酸铝显色法测定总黄酮[17]。取芦丁用甲醇配制成0.837 g/L的母液，精密量取芦丁对照品溶液0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于10 mL容量瓶内，分别加入0.4 mL亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6 min，加入0.4 mL 10%硝酸铝溶液，摇匀，放置6 min，加入4 mL氢氧化钠试液，加水至刻度线，混匀，避光放置15 min。以相应对照品溶液为空白，按照紫外分光光度法扫描全波长，最大吸收波长为499 nm，并测其吸光度值。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，回归曲线方程为Y=1 002.4X-0.006 5（R2=0.998 3）。1.4单因素试验以全缘金粟兰总黄酮提取率为指标，分别对乙醇体积分数（20%、30%、40%、50%、60%）、超声时间（10、20、30 min）、液料比（20、40、60、80 mL/g）进行单因素试验。1.5正交试验设计分析单因素试验结果，增加一个空白对照组，建立4因素3水平正交试验（见表1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平A乙醇体积分数/%B超声时间/minC提取液料比/(mL/g)1351535240204034525451.6全缘金粟兰地上与地下总黄酮体外抗氧化能力研究分别精密量取2、4、6、8、10 mL全缘金粟兰地上与地下总黄酮提取液置于25 mL容量瓶中，用体积分数45%的乙醇溶液定容摇匀，保存，备用。1.6.1清除DPPH自由基试验根据参考文献[18]的方法配置不同浓度的全缘金粟兰总黄酮溶液，以VC作阳性对照。在517 nm下测定其吸光度。按照式（1）计算DPPH自由基的清除率：DPPH自由基清除率=A0-A1-A2A0×100% (1)式中：A1为加黄酮提取液后的吸光度值；A2为黄酮提取液的吸光度值；A0为未加提取液时的吸光度值。1.6.2清除羟自由基试验根据参考文献[19]的方法进行试验，以VC作阳性对照。在510 nm下测定吸光度。按照式（2）计算羟自由基的清除率：羟自由基清除率=Ac-Ai-AjAc×100% (2)式中：Ac为未加提取液时的吸光度值；Ai为加提取液时的吸光度值；Aj为未加过氧化氢时的吸光度值。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇体积分数对全缘金粟兰总黄酮提取率的影响（见图1）由图1可知，全缘金粟兰总黄酮提取率在20%~40%呈上升趋势，在乙醇体积分数为40%时，提取率达到最大，当乙醇体积分数超过40%时，可能随着其他杂质的溶出增加，导致其提取率降低，因此选择乙醇体积分数35%、40%、45%进行正交优化设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.F001图1乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响2.1.2超声时间对全缘金粟兰总黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，随着超声时间的增加，全缘金粟兰总黄酮提取率先升高后降低，超声20 min时，总黄酮提取率最大，可能由于长时间超声破坏了黄酮类化合物，因此选择超声时间为15、20、25 min进行正交优化设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.F002图2超声时间对总黄酮提取率的影响2.1.3液料比对全缘金粟兰总黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，随着液料比增大，全缘金粟兰总黄酮提取率先升高后降低，液料比为40 mL/g时，提取率最大，因此，选择液料比为35、40、45 mL/g进行正交优化设计。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.F003图3液料比对总黄酮提取率的影响2.2正交试验结果全缘金粟兰总黄酮L9(34)正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。3个因素均对总黄酮提取率无显著性影响，综合极差分析可得，全缘金粟兰总黄酮的最佳提取工艺条件为A3B1C3，即乙醇体积分数45%，超声提取15 min，液料比45 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.T002表2正交试验结果项目ABCD总黄酮提取率/%111114.75212225.45313335.70421235.05523113.85622326.49731327.74832135.04933215.18k15.305.855.434.59k25.134.785.236.56k35.995.795.765.26R0.861.070.530.9710.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.T003表3方差分析结果项目离差平方和自由度均方F值P值A0.6220.310.21＞0.05B1.0820.540.36＞0.05C0.2220.110.07＞0.05误差2.9921.502.3验证试验称取全缘金粟兰3份，按最佳提取工艺进行提取和测定，总黄酮提取率平均值为7.68%，RSD为2.4%，故该正交试验设计条件稳定可行。2.4全缘金粟兰地上与地下部位总黄酮抗氧化试验2.4.1全缘金粟兰地上与地下部位总黄酮对DPPH自由基清除能力（见图4）由图4可知，全缘金粟兰地上、地下部位总黄酮与VC对DPPH自由基的清除率在一定质量浓度范围内均呈现量效关系，但是VC对DPPH自由基的清除效果更好。全缘金粟兰地下部位总黄酮对于DPPH自由基的清除率要高于同质量浓度的地上部位的总黄酮，并且两者对于DPPH自由基的清除率在质量浓度为0.085~0.450 g/mL的范围内呈现一定的量效关系，两者分别在0.425、0.460 g/mL时对DPPH自由基的清除率高达98.3%和98.2%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.F004图4全缘金粟兰地上与地下部位黄酮对DPPH自由基的清除能力2.4.2全缘金粟兰地上与地下部位总黄酮对羟自由基清除能力（见图5）由图5可知，全缘金粟兰地上、地下部位总黄酮与VC对羟自由基的清除率在一定质量浓度范围内均呈现量效关系，但是VC对羟自由基的清除效果更好。全缘金粟兰地上部位总黄酮对于羟自由基的清除率要高于同质量浓度的地下部位的总黄酮，并且两者对于羟自由基的清除率在质量浓度为0.085~0.450 g/mL的范围内呈现量效关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.018.F005图5全缘金粟兰地上与地下部位总黄酮对羟自由基清除能力3讨论本研究中体外抗氧化活性试验结果表明，全缘金粟兰地上或者地下部位总黄酮对DPPH自由基及羟自由基的清除能力均成一定的量效关系，均具有开发为动物生产的抗氧化应激剂使用的潜力。但是同等质量浓度下两者对于DPPH自由基及羟自由基的清除能力相反，这可能由于全缘金粟兰地上与地下部位所含有的黄酮类化合物种类或者比例不同，虽然没有VC对DPPH自由基及羟自由基的清除能力强，但也为其物质成分基础研究以及药材使用部位的选择提供了研究方向和依据。4结论采用超声提取法对全缘金粟兰总黄酮进行提取，通过单因素及正交试验分析得出其最佳提取工艺为乙醇体积分数45%、超声时间15 min、液料比45 mL/g。此工艺条件下，全缘金粟兰总黄酮提取率为7.68%。其中全缘金粟兰地上与地下部位分别在0.425、0.460 g/mL时对DPPH自由基的清除率高达98.3%和98.2%；两者对羟自由基的清除率在质量浓度为0.085~0.450 g/mL的范围内呈现一定的量效关系。