畜牧业抗生素滥用导致的安全隐患引起广泛关注[1-2]，我国已于2020年7月开始禁止在饲料端添加抗生素[3]。中草药具有药效优良、不易产生耐药性、毒副作用小、药物残留低、绿色环保等优点。中草药的细胞壁是由纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等难降解成分构成的致密结构层，其包裹的活性成分不易被动物机体吸收利用。微生物发酵中药时，不仅可利用中药的营养成分为自身生长、繁殖提供部分营养，而且微生物生长代谢产生的纤维素酶、半纤维素酶等酶类还可裂解中草药细胞壁纤维，促进中药活性成分向胞外释放游离，从而提高中药活性成分的利用率，增强中药药效，降低中药毒副作用，节省中药材资源[4-5]。本研究前期从自然环境中分离鉴定出一株高产纤维素酶、漆酶的糙皮侧耳菌[6]，为探究该菌发酵中药的可行性，对糙皮侧耳菌发酵复方中药的基质成分和配比进行筛选，旨在为糙皮侧耳菌液态发酵中药提供一定参考。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1中药材与试剂黄芪、白术、蒲公英、甘草等中草药由哈尔滨绿达生动物药业有限公司惠赠；玉米粉、黄豆、绿豆购自齐齐哈尔某粮油超市；碳酸钙、蔗糖、可溶性淀粉、羧甲基纤维素钠、葡萄糖、3, 5-二硝基水杨酸、硝酸铵、尿素、磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙、硫酸锰、可溶性淀粉等试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司。1.1.2菌种与培养基菌株HXS-M1经鉴定为糙皮侧耳菌（Pleurotus ostreatus），由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院微生物研究室分离并保存。葡萄糖蛋白胨琼脂培养基（DPA）[7]：葡萄糖20 g，蛋白胨2 g、琼脂20 g、纯净水1 L，pH值自然。葡萄糖蛋白胨培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、纯净水1 L，pH值自然。单味中药琼脂培养基：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、琼脂20 g、单味中药提取液100 mL、纯净水900 mL，pH值自然。复方中药培养基：复方中药提取液400 mL、纯净水600 mL，pH值自然。1.1.3仪器设备ME104型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、PHM-53型全自动高压蒸气灭菌器（上海尧勋智能科技有限公司）、Scb-1360型双人垂直超净工作台（无锡一净净化设备有限公司）、DHP-9162型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）、721N型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）、HWS-24型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）、SH-3型磁力搅拌器（天津市泰斯特仪器有限公司）、HZQ-F100型恒温振荡培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司）、数显游标卡尺（香港欧克工具（国际）有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌株HXS-M1与中药适应性试验1.2.1.1中药粗提液制备取黄芪、白术、蒲公英、甘草各250 g，分别加水1 L，煮沸后文火煎煮30 min，过滤，滤渣加水1 L，文火煎煮30 min，过滤，合并两次滤液并浓缩至250 mL，即为制备药液，药液含药量相当于中药干粉1 g/mL。1.2.1.2菌株HXS-M1与单味中药适应性试验取糙皮侧耳菌菌种接种DPA平板，28 ℃培养5 d，采用直径9 mm的无菌打孔器在菌落边缘制取菌饼。取菌饼分别接种单味中药琼脂培养基平板中央，每个平板接种1块菌饼，并以普通DPA平板做对照，每种平板作5个平行。平板28 ℃培养，每天观察记录菌丝生长情况，培养至第5 d时，使用游标卡尺测量菌落直径并记录。1.2.2纤维素酶活力测定取10 mL糙皮侧耳菌培养液，6 000 r/min离心15 min，取上清液（即粗酶液），置于4 ℃冰箱保存。参照技术规范NY/T 912—2020，采用DNS定糖法测定纤维素酶酶活[8]。1.2.3发酵中药基质的单因素筛选1.2.3.1种子液制备应用打孔器采取直径为9 mm的活化糙皮侧耳菌菌块，接种于100 mL葡萄糖蛋白胨液体培养基中，28 ℃、120 r/min振荡培养7 d。1.2.3.2碳源筛选按照受试碳源的碳含量基本一致原则[9-11]，通过相同含碳量换算，在复方中药提取液培养基中分别添加20.0 g/L葡萄糖、19.9 g/L蔗糖、18.0 g/L可溶性淀粉、20.0 g/L玉米粉、20.0 g/L马铃薯作为碳源，培养基其他成分不变，按体积比5%接入种子液，28 ℃、120 r/min振荡培养15 d，确定产酶最优碳源。分别添加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%的最优碳源进行发酵培养，其余条件不变，确定最适碳源添加量。1.2.3.3氮源筛选按照受试氮源的氮含量基本一致原则[10,12-13]，在复方中药提取液培养基中分别添加2.0 g/L蛋白胨、8.0 g/L黄豆粉、10.0 g/L绿豆粉、1.2 g/L硝酸铵、0.6 g/L尿素作为氮源，培养基其他成分不变。按体积比5%接入种子液，28 ℃、120 r/min振荡培养15 d，确定产酶最优氮源。分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的最优氮源进行发酵培养，其余条件不变，确定最适氮源添加量。1.2.3.4无机盐筛选参照糙皮侧耳菌营养需要[7,14-15]，在复方中药提取液培养基中分别添加1.0 g/L磷酸二氢钾、1.2 g/L硫酸镁（MgSO4·7H2O）、1.0 g/L碳酸钙、0.3 g/L硫酸锰，培养基其他成分不变。按体积比5%接入种子液，28 ℃、120 r/min振荡培养15 d，确定产酶最优无机盐。分别添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的最优无机盐进行发酵培养，其余条件不变，确定最适无机盐添加量。1.3发酵中药基质的响应面优化试验1.3.1试验设计依据糙皮侧耳菌发酵中药目的及产业化生产条件，在单因素试验结果的基础上采用Box-Benhnken中心组合试验设计。以中药提取液、绿豆粉、碳酸钙添加量3因素3水平进行回归，拟合各因素与响应值纤维素酶含量的关系，利用Design Expert 12.0软件系统进行响应面分析，得到中药提取液培养基的最佳配比。响应面优化试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T001表1Box-Behnken试验设计水平A中药提取液B绿豆粉C碳酸钙-1350.800.080401.000.101451.200.12%1.3.2验证试验取优化的中药提取液培养基，按体积比5%接入种子液，28 ℃、120 r/min振荡培养15 d，测定培养液中的纤维素酶活力，验证预测结果的准确性。1.4数据统计与分析应用Excel 2010作图，SPSS 26.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。应用Design Expert 12.0软件建立多元二次模型方程进行方差分析，绘制响应面图和等高线图；数据优化程序计算纤维素酶含量最大值时培养基成分优化值。2结果与分析2.1菌种与中药的适应性（见表2）由表2可知，4种单味中药培养基生长的菌落大小与DPA培养基菌落相比差异不显著（P0.05），各单味中药培养基的菌落大小差异也不显著（P0.05），表明菌株HXS-M1在含有不同中药提取液的培养基上均可正常生长，菌株HXS-M1与各味中药间具有良好的适应性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T002表2菌株HXS-M1在不同培养基中的生长情况项目黄芪琼脂培养基甘草琼脂培养基蒲公英琼脂培养基白术琼脂培养基DPA结果6.51±0.216.31±0.245.99±0.176.05±0.466.19±0.37注：同行数据肩标相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05），不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。cm2.2单因素筛选结果2.2.1最优碳源及添加量筛选结果（见表3、表4）由表3可知，复方中药提取液培养基中加入不同碳源对菌株的产纤维素酶影响不显著（P0.05），由此确定应用糙皮侧耳菌株HXS-M1发酵复方中药提取液培养基时可不另行添加碳源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T003表3不同碳源对菌株HXS-M1产纤维素酶活力的影响项目葡萄糖蔗糖可溶性淀粉玉米粉马铃薯复方中药提取液结果27.29±0.5327.38±0.5327.24±0.8428.31±0.5828.19±0.8327.96±0.71U/mL由表4可知，复方中药提取液添加量为40%时，纤维素酶活力最高，达到28.09 U/mL，因此选择40%作为复方中药提取液的最优添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T004表4复方中药提取液添加量对菌株HXS-M1产纤维素酶活力的影响项目10%20%30%40%50%60%70%结果18.93±0.56E23.39±0.51CD26.15±0.40B28.09±0.61A26.62±0.53B24.48±0.49C22.34±0.60DU/mL2.2.2最优氮源及添加量筛选结果（见表5、表6）由表5可知，蛋白胨、黄豆粉与绿豆粉作为氮源时，菌株的产酶活力极显著高于尿素、硝酸铵及复方中药提取液培养基（P0.01），但蛋白胨、黄豆粉与绿豆粉间差异不显著（P0.05），表明蛋白胨、黄豆粉和绿豆粉是菌株产纤维素酶的优选氮源，综合分析各氮源的性价比及研发发酵中药的功效，确定绿豆粉作为最优氮源。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T005表5不同氮源对菌株HXS-M1产纤维素酶活力的影响项目蛋白胨黄豆粉绿豆粉硝酸铵尿素复方中药提取液结果32.19±0.62A32.78±0.39A32.68±0.51A25.24±0.72C26.30±0.97BC27.86±0.70BU/mL由表6可知，绿豆粉添加量为1.0%时，纤维素酶活力最高，因此选择1.0%作为绿豆粉的最优添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T006表6绿豆粉添加量对菌株HXS-M1产纤维素酶活力的影响项目0.5%1.0%1.5%2.0%2.5%3.0%结果28.36±0.55C32.52±0.57A30.75±0.64B26.83±0.61D25.75±0.38DE24.45±0.41EU/mL2.2.3最优无机盐及添加量筛选结果（见表7、表8）由表7可知，碳酸钙作为无机盐时，菌株产纤维素酶活力极显著高于其他无机盐及复方中药培养基（P0.01），表明添加碳酸钙有利于激发菌株的产纤维素酶活力，其产酶活力优于其他无机盐和复方中药培养基，因此选择碳酸钙作为最优无机盐。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T007表7不同无机盐对菌株HXS-M1产纤维素酶活力的影响项目磷酸二氢钾硫酸镁碳酸钙硫酸锰复方中药提取液结果26.96±0.77BC26.87±0.65BC30.61±0.30A26.09±0.54C27.75±0.60BU/mL由表8可知，碳酸钙添加量为0.10%时纤维素酶活力最高，因此选择0.10%作为碳酸钙的最优添加量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T008表8碳酸钙添加量对菌株HXS-M1产纤维素酶的影响项目0.05%0.10%0.15%0.20%0.25%结果28.03±0.46C31.06±0.50A30.73±0.56A29.69±0.58AB29.08±0.59BCU/mL2.3复方中药发酵培养基优化结果（见表9）根据Box-Behnken中心复合设计原理，以中药提取液添加量（A）、绿豆粉添加量（B）和碳酸钙添加量（C）为3个自变量，以纤维素酶活力（Y）为因变量设计3因素3水平的响应面分析试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T009表9响应面试验结果编号ABCY/(U/mL)1-11030.372-10131.113-10-130.564-1-1027.25500038.22601134.05700038.51800037.9790-1-131.991000038.941100040.491201-132.70130-1131.65141-1031.681510-136.911610138.651711037.732.3.1模型建立及方差分析（见表10）采用Design Expert 12软件分别对纤维素酶活力（Y）优化试验结果进行多元回归拟合分析，回归模型：Y=38.83+3.21A+1.54B+0.41C+0.73AB+0.30AC+0.42BC-2.68A2-4.39B2-1.84C2。对二次模型进行方差和显著性分析。由表10可知，试验结果所选模型P值小于0.01，表明显著性极高。失拟检测P值大于0.05，模型决定系数R2值均在0.9以上，表明模型与试验情况拟合良好，可用于分析和预测最佳产酶条件。方差分析结果表明，中药提取液添加量和绿豆粉添加量对纤维素酶活力影响显著；而碳酸钙添加量因素对纤维素酶活力影响不显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.T010表10回归模型的方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型243.84927.0920.330.000 3A82.43182.4361.860.000 1B18.85118.8514.150.007 1C1.3611.361.020.345 8AB2.1512.151.610.245 0AC0.3510.350.260.622 1BC0.7110.710.530.488 0A²30.22130.2222.680.002 1B²81.12181.1260.870.000 1C²14.24114.2410.690.0137残差9.3371.33失拟值5.3531.781.790.288 3纯误差3.9840.99总误差253.1616注：P0.05表示影响显著；P0.01表示影响极显著。2.3.2各因素交互作用对纤维素酶活力的影响（见图1）由图1可知，中药提取液添加量和绿豆粉添加量因素交互作用对纤维素酶活力影响等高线图均趋近圆形，表明两者交互作用对酶活力影响不显著。中药提取液添加量与碳酸钙添加量及绿豆粉添加量与碳酸钙添加量的交互作用对酶活力影响均不显著。中药提取液添加量由35%增加至45%时，绿豆粉添加量由0.8%增加至1.2%，碳酸钙添加量由0.08%增加至0.12%，酶活力均呈先升高后下降趋势，凸起顶点处即为响应优化最大值。图1因素交互作用对纤维素酶活力影响的等高线和响应面图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.F1a1（a）中药提取液与绿豆粉对纤维素酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.F1a2（b）绿豆粉与CaCO3对纤维素酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.019.F1a3（c）中药提取液与CaCO3对纤维素酶活力的影响2.3.3响应面优化及验证试验结果采用Expert Design 12软件分析得到纤维素酶最优液体培养基为中药提取液添加量43.124%，绿豆粉添加量1.048%，碳酸钙添加量0.104%，预测值为40.08 U/mL。为验证试验方案的有效性，并考虑实际操作便利，将最优培养条件调整为中药提取液43.0%、绿豆粉1.0%、碳酸钙0.1%，该条件下进行3次平行试验，试验结果分别为39.82、40.16、39.78 U/mL，取平均值为39.92 U/mL，与预测值40.08 U/mL相近，表明优化结果准确可靠。3讨论糙皮侧耳菌具有强大的纤维降解能力，许多富含纤维素的植物均可作为自身生长的营养碳源[16]，如玉米芯、秸秆等植物纤维，该特性在本试验的碳源筛选试验中也得到了证实。本试验中，在未另行添加碳源的条件下，糙皮侧耳菌的产纤维素酶活力仍较理想，表明中草药为其生长提供了碳源，原因可能是黄芪、甘草等中草药均含有多糖等活性或营养成分，可作为发酵菌生长的碳源。此外，发酵中草药含有一定植物纤维，糙皮侧耳菌还可降解中草药的纤维成分为自身生长提供碳源。本试验结果与相关研究结论一致。乔宏兴等[17]发现黄芪可作为营养基质为乳酸菌生长提供碳源营养，能够在一定程度上促进乳酸菌生长。朱新术[18]研究表明，不同浓度的黄芪药液能够促进乳酸菌生长。贾艳姝[19]应用黄芪提取液培养保加利亚乳杆菌也得出类似结论。绿豆是一种食药同源植物，富含蛋白质、氨基酸、维生素、微量元素等营养成分，还含有鞣质、香豆素、生物碱、植物甾醇、皂苷、黄酮类化合物等生物活性物质，具有清热解毒、消暑利水等药用功效[20-23]。绿豆粉经糙皮侧耳菌的生物转化还可产生多肽、异黄酮等活性成分，增添抗氧化、增强免疫功能、抑菌、促进消化吸收等新功效[24]。考虑到本试验旨在研发一种食药同源的保健添加剂，最终确定绿豆粉作为筛选的氮源材料，以便增强研制发酵中草药添加剂的应用效果。随着国家减抗、限抗政策实施，中药日益受到畜牧行业的重视。但有些中药粗纤维含量高，生物利用度低；有些中药适口性不佳，影响中药在畜牧业中的进一步推广应用。中药经微生物发酵后能够提高利用率，增强药效，降低毒副作用，改善适口性[25]，具有提高动物生长性能、提高机体免疫力、抑菌抗病毒、调节肠道菌群平衡等功能[26]。侧耳菌具有抗肿瘤、抗氧化、增强免疫等多种药理作用，生长繁殖能力强，营养物质要求低，易培养，具有营养和药用双重价值。侧耳菌的生长繁殖过程中可产生丰富的木聚糖酶、锰依赖过氧化物酶、纤维素酶、半纤维素酶、漆酶等酶系，具有很强的降解木质素、纤维素等植物纤维能力[16]，因而利用侧耳菌发酵降解中草药具有广阔的开发前景。本研究利用分离筛选的一株具有较强产纤维素酶、漆酶活力的糙皮侧耳菌发酵复方中药，旨在提高中草药与真菌的利用率，增强中草药药效，从而研发高效的发酵中草药添加剂。4结论本试验以糙皮侧耳菌作为复方中药发酵菌种，以菌株产纤维素酶活力为考核指标，采用单因素试验结合响应面试验，优化确定复方中药的液态发酵基质配比为复方中药提取液43.0%、绿豆粉1.0%、碳酸钙0.1%，在28 ℃、120 r/min振荡培养15 d，菌株产纤维素酶活力较理想，达到39.92 U/mL。