迷迭香是唇形科迷迭香属草本植物[1-2]。迷迭香富含迷迭香酸、鼠尾草酸、鼠尾草酚和黄酮等活性成分。迷迭香提取物具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、护肝保胃等作用[3-4]。沙门氏菌属肠杆菌科是一种常见的食源性病原体，能够破坏动物肠道屏障，引发胃肠道疾病[5-6]。研究表明，中药及其提取成分具有调节免疫、增强机体免疫、消除炎症反应等药理活性[7]。在饲粮中添加迷迭香提取物可以提高奶山羊抗氧化能力[8]。万研等[9]研究发现，车前可以提高雏鸡的免疫功能，对肠道形态起保护作用，有效缓解沙门氏菌对肉雏鸡的感染损伤。目前，应用中药及其衍生物防治沙门氏菌疾病已成为研究热点[10]。迷迭香具有良好的抗菌效果[11-12]，但用于体内畜禽沙门细菌疾病的研究较少。本研究旨在探究迷迭香水提物制备的最佳工艺，探究日粮中添加迷迭香水提物对沙门氏菌感染小鼠肠道的保护及抗炎作用，为迷迭香提取物在动物生产中的应用提供一定参考。1材料与方法1.1试验材料40只5周龄、体重（20±2）g、健康的SPF级雌性BALB/c小鼠购自广州市言诚生物科技有限公司。迷迭香购自广西玉林药材批发市场，迷迭香酸对照品购自上海麦克林生化科技有限公司（纯度≥98%）。沙门氏菌由本实验室分离，鉴定，保存。1.2试验试剂及仪器乙腈、甲醇（色谱纯）购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，磷酸（分析纯）购自天津市科密欧化学试剂有限公司。小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）ELISA试剂盒均购自上海源桔生物科技中心。LC-20AT高效液相色谱仪、ODS-3色谱柱（4.6 mm × 250 mm，5 µm）购自日本岛津公司；ULPHW优普超纯水机购自郑州优尔普仪器设备有限公司；MX-50快速水分测定仪购自日本艾安得股份有限公司。1.3测定指标及方法1.3.1迷迭香水提物的制备称取100 g迷迭香，按相应的液料比加入相应pH值的蒸馏水，浸泡30 min使药材完全湿润，加热回流，冷却至室温，收集提取液，过滤，浓缩至100 mL。取2 mL浓缩液，使用纯水稀释至25 mL，0.22 μm有机系微孔滤膜过滤。1.3.2HPLC测定提取物中迷迭香酸含量流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液（2∶8），等度洗脱，流速1.0 mL/min，柱温25 ℃，检测波长330 nm，进样10 μL。使用HPLC检测迷迭香提取液中迷迭香酸含量[13]。迷迭香酸提取率=提取液中迷迭香酸浓度×提取液体积/迷迭香重量×100%(1)1.3.3对照品及供试品溶液的制备称取15.00 g迷迭香酸对照品，置于容量瓶中，加15 L甲醇定容。制成1.00 g/L迷迭香酸对照品储备液。称取1.00 g迷迭香于具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，加热回流1 h，冷却，补重，加入甲醇定容。1.3.4系统适用性试验吸取迷迭香酸对照品溶液、迷迭香水提液和阴性对照品，按照1.3.2进行测定，对照品和迷迭香水提物中各色谱图分离良好，见图1。图1对照品和迷迭香水提物HLPC图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.F1a1（a）对照品10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.F1a2（b）迷迭香水提物1.3.5标准曲线的绘制按照1.3.3方法制备迷迭香酸对照品母液，稀释质量浓度为1.00、0.80、0.60、0.40、0.20、0.10、0.05 g/L。以迷迭香酸对照品为横坐标（x），以峰面积为纵坐标（y），绘制迷迭香酸标准曲线。1.3.6单因素试验考察不同加水倍数（10、12、14、16、18）、提取时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）、提取次数（1、2、3、4）、提取液pH值（4、5、6、7、8）对迷迭香酸提取率的影响，每个试验重复3次。1.3.7正交试验设计在单因素试验基础上，筛选出对迷迭香酸提取率影响最大的3个因素，分别为提取次数（A）、液料比（B）、提取液pH值（C），每个因素设置3个水平，设计正交试验，优化提取工艺，计算提取液中迷迭香酸含量、转移率、干膏率、综合指标，正交试验因素水平设计见表1。提取液中迷迭香酸含量=浓缩液中迷迭香酸浓度×浓缩液体积(2)转移率=提取液中迷迭香酸含量/迷迭香药材中迷迭香酸的总含量×100%(3)出膏率=1-提取液浓缩液中水分含量(4)综合指标=转移率×0.6+出膏率×0.4(5)10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.T001表1正交试验因素水平设计水平A提取次数B液料比/(mL/g)C pH值1112422145331661.3.8小鼠肠道抗炎试验1.3.8.1试验设计小鼠适应性饲养7 d后，选取40只小鼠随机分成5组，分别为高（1 g/kg）、中（0.5 g/kg）、低（0.25 g/kg）剂量迷迭香水提取物组、沙门氏菌模型组、空白组。饲喂小鼠14 d，每隔2 d测量小鼠体重。第14 d，除空白组外，其他组小鼠腹腔注射0.2 mL 107 CFU/mL沙门氏菌。试验最后1 d，小鼠称重后眼球采血。1.3.8.2小鼠脏器指数分离小鼠肝脏、肾脏和脾脏，称重，计算器官指数[14-15]。肝脏指数=肝脏重量/小鼠体重×100%(6)肾脏指数=肾脏重量/小鼠体重×100%(7)脾脏指数=脾脏重量/小鼠体重×100%(8)1.3.8.3血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量乙醚麻醉小鼠后进行眼球采血，4 ℃斜面静置2 h，3 000 r/min离心10 min，取血清置于-80 ℃保存，采用ELISA试剂盒测定TNF-α、IL-6和IL-1β含量。1.3.8.4十二指肠HE染色取小鼠十二指肠组织固定于福尔马林24 h，将组织从固定液中取出，脱水，石蜡包埋，切片，常规HE染色，脱水，二甲苯透明，以中性树胶封片，置于光学显微镜下观察。1.4数据统计与分析采用SPSS 20软件对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1迷迭香酸标准曲线测定迷迭香酸的线性回归方程为：y=28 233 147x-350 596（R=0.999 9），表明迷迭香酸对照品在0.05~1.00 g/L内线性关系良好。2.2单因素试验结果（见图2）由图2（a）可知，提取时间为1.5 h时，迷迭香酸提取率最高。由图2（b）可知，随着液料比增加，迷迭香酸提取率呈先上升再下降趋势，液料比为14 mL/g时，迷迭香酸提取率达到最高。由图2（c）可知，迷迭香酸提取率随着提取次数增加而增加，但增幅不明显，提取2次时迭香酸提取率最高。由图2（d）可知，提取液pH值为5时，迷迭香酸提取率最高。图2提取时间、液料比、提取次数和提取液pH值对迷迭香酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.F2a1（a）提取时间对迷迭香酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.F2a2（b）液料比对迷迭香酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.F2a3（c）提取次数对迷迭香酸提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.F2a4（d）提取液pH值对迷迭香酸提取率的影响2.3正交试验及方差分析结果（见表2、表3）由表2可知，根据R值判断影响提取工艺的排序为提取次数（A）液料比（B）提取液pH值（C），最佳组合为A3B3C2，即水提取3次、液料比16 mL/g、提取液pH值5，迷迭香水提物综合指标为68.78%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.T002表2正交试验结果项目ABC综合指标/%111149.73212250.20313350.67421261.20522360.91623163.04731165.00832360.52933268.78k150.2058.6457.76k261.7257.2160.06k364.7760.8358.86R14.573.622.30最优组合A3B3C2由表3可知，提取次数（A）对迷迭香酸提取率有显著影响（P0.05），液料比（B）、提取液pH值（C）对迷迭香酸提率无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值修正模型382.07663.6813.510.071截距31 222.58131 222.586 624.420.000A354.162177.0837.570.026B19.9929.992.120.320C7.9223.960.840.540误差9.4224.71注：P0.05表示影响显著。2.4迷迭香水提物对沙门氏菌致小鼠肠道损伤的影响2.4.1迷迭香水提取物对脏器指数的影响（见表4）由表4可知，与空白组相比，沙门氏菌模型组小鼠肝脏、肾脏和脾脏指数升高。与空白组相比，沙门氏菌模型组小鼠肝脏指数极显著升高（P0.01），脾脏指数显著升高（P0.05）。与沙门氏菌模型组比，高、中、低剂量组小鼠肝脏、肾脏和脾脏指数均降低。研究表明，迷迭香水提物对小鼠脏器具有保护作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.T004表4迷迭香水提物对小鼠脏器指数的影响组别肝脏指数肾脏指数脾脏指数空白组46.40±1.0713.28±0.914.56±0.35沙门氏菌模型组52.45±2.23##14.67±1.195.48±0.31#高剂量组49.53±2.0214.47±1.254.92±0.37中剂量组50.43±1.4314.36±0.904.84±0.35低剂量组49.81±1.8614.89±1.435.16±0.47注：与空白组比，“#”表示差异显著（P0.05），“##”表示差异极显著（P0.01），无标记表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.4.2迷迭香水提取物对小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量的影响（见表5）由表5可知，与空白组比，沙门氏菌模型组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量极显著上升（P0.01）。与沙门氏菌模型组比，高、中、低剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均降低。与沙门氏菌模型组相比，高剂量组小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量均显著降低（P0.05）；中剂量组小鼠血清中IL-6、IL-1β含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.T005表5迷迭香水提物对小鼠血清中TNF-α、IL-1β及IL-6含量的影响组别TNF-αIL-6IL-1β空白组112.16±14.577.17±1.1419.62±2.44沙门氏菌模型组180.14±8.53##15.71±1.53##32.71±3.12##高剂量组162.21±10.52*9.91±1.70*25.74±2.45*中剂量组171.47±9.459.17±1.29*25.32±3.12*低剂量组172.84±9.3311.89±2.5228.59±3.16注：与沙门氏菌模型组相比，“*”表示差异显著（P0.05）。ng/L2.4.3小鼠十二指肠HE染色结果（见图3）由图3可知，空白组小鼠肠黏膜结构完整、绒毛结构未受损、腺体排列正常。与空白组相比，沙门氏菌模型组小鼠十二指肠黏膜上皮细胞脱落，肠绒毛结构破坏严重。与沙门氏菌模型组比，高、中、低剂量组小鼠上皮细胞脱落减少，肠绒毛结构破坏较轻，表明迷迭香水提物对小鼠肠道起一定的保护作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.017.F003图3小鼠十二指肠HE染色观察（40×）3讨论3.1迷迭香水热回流提取工艺优化结果分析中草药提取物的提取方法有微波提取法、超声提取法、超临界流体萃取法和酶辅助法[16]。邱艳等[17]采用微波辅助提取迷迭香中中酚类化合物，考察物料粒径大小、提取时间、温度、乙醇浓度和液料比对迷迭香酚类物质提取率的影响，发现提取最优工艺为80%乙醇、液料比为12 mL/g、提取时间30 min、提取温度55 ℃。王秀等[18]利用超声波提取法优化康定鼠尾草中迷迭香酸的提取工艺，发现最优提取工艺为液料比为14 mL/g、提取时间30 min、提取3次。上述方法可提高迷迭香提取物的提取率，缩短提取时间，但其对技术要求高，成本增加，实用性较低。浸渍、煎煮和回流等传统提取方法具有成本低的优势，在生产中更容易被接受[19-20]。迷迭香酸是一种天然水溶性多酚酸，易溶于水、乙醇和丙酮[21-22]。本试验中，随着溶液pH值升高，迷迭香酸提取率呈下降趋势；提取液pH值为5时，迷迭香酸提取率最高。迷迭香酸最佳提取工艺为水提3次、液料比16 mL/g、提取溶液pH值为5，表明迷迭香酸水提法操作简单、污染低、成本低的优势。3.2迷迭香水提物对沙门氏菌致小鼠肠道损伤的影响沙门氏菌感染会引起小鼠肠道内的急性黏膜炎[23-24]。感染沙门氏菌会影响小鼠的脾脏、肝脏和肠道组织[25]。本试验中，与空白组相比，小鼠经沙门氏菌感染后，脏器指数显著升高，血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均升高，病理切片显示小鼠肠黏膜损伤，表明沙门氏菌引起小鼠急性黏膜炎症；与沙门氏菌模型组比，高剂量迷迭香水提物组小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量降低，表明高剂量迷迭香水提物对血清中的炎性因子有抑制作用。有研究表明，中药可降低小鼠炎症细胞因子的释放，改善感染症状，提高小鼠免疫力[26-27]。还有研究发现，迷迭香酸通过抑制炎症反应和增强抗氧化能力对小鼠肝脏和肾脏起到保护作用[28-29]。十二指肠损伤会导致小鼠营养物质吸收障碍[30-31]。本试验中，与空白组相比，沙门氏菌攻毒使小鼠十二指肠黏膜上皮细胞严重脱落，肠绒毛结构被破坏。研究表明，沙门氏菌破坏了小鼠十二指肠形态结构，引发了小鼠肠道炎症，不利于小鼠消化吸收营养物质。本试验中，与沙门氏菌模型组比，迷迭香水提物组小鼠十二指肠黏膜上皮细胞脱落降低，肠绒毛结构更完整，表明迷迭香水提物可以改善沙门氏菌攻毒引起的肠形态结构损伤，有利于维护小鼠肠道健康。有研究发现，百里香酸和迷迭香酸可以显著提高小鼠空肠黏膜绒毛高度，减少小鼠肠道黏膜损伤[32]。4结论本试验采用水热回流法提取迷迭香水提物，最佳工艺为提取3次、液料比16 mL/g、提取溶液pH值为5，迷迭香酸综合指标为68.78%。小鼠肠道抗炎试验结果表明，迷迭香水提物可以改善沙门氏菌攻毒引起的小鼠肠道黏膜损伤，有利于维护小鼠肠道健康。