棕榈仁粕（palm kernel meal，PKM）是棕榈仁脱壳后榨油的副产品，为棕褐色的颗粒，具有咖啡香和酒香味[1]。PKM含有14%~18%的粗蛋白质（CP）、3%~9%的粗脂肪（EE）、12%~20%的粗纤维（CF）及矿物质[2]，可替代部分豆粕和玉米，但PKM中的高纤维限制了应用。利用微生物和酶降解纤维素对PKM进行固态发酵可以提高PKM营养价值。黑水虻（Hermetia illucens L.）作为一种资源昆虫，可作为大量有机废弃物（餐厨[3]、动物尸体和粪便[4- 5]、渗滤液污泥[6]等）的处理介质，利用昆虫的取食转化建立安全、有效的生物处理系统，消除有机废弃物的污染问题。黑水虻幼虫（BSFL）和预蛹富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质、壳聚糖及抗菌肽[7-8]，可作为水产、畜禽、家禽动物饲料。Hogsette[9]提出，使用50%麦麸、30%苜蓿粉、20%玉米粉可用于生产稳定的家蝇，这种饲料被称为Gainesville diet。Tomberlin等[10]发现，Gainesville diet同样适用于黑水虻养殖。随着Gainesville diet的广泛运用，以植物基原料饲养黑水虻正式兴起。一些安全性原料如蔬菜、水果[11]、花生麸[12]、豆粕[13]等基质得到应用挖掘。目前，棕榈仁粕在黑水虻养殖中研究较少，本试验使用棕榈仁粕饲养黑水虻，旨在为人工饲养黑水虻提供参考。1材料与方法1.1试验材料黑水虻虫卵由生物源生物技术（深圳）股份有限公司提供。PKM由东莞市富之源饲料蛋白开发有限公司提供，营养水平为粗蛋白质16%、粗脂肪4%、粗纤维25%、粗灰分7%、水分13%、无氮浸出物35%。发酵菌粉（酵母菌∶枯草芽孢杆菌∶乳酸菌=2∶1∶3）由生物源生物技术（深圳）股份有限公司提供；β-甘露聚糖酶（3 000 U/g）由沧州夏盛酶生物技术有限公司提供。1.2试验设计1.2.1发酵PKM的制备将PKM粉碎过40目筛，放入直径18 cm，高27 cm，总体积为5 L的立圆形发酵桶中，分别接入5%菌粉和β-甘露聚糖酶（菌酶比1∶1），加入蒸馏水（液料比3∶2），搅拌均匀，封口，置于37 ℃培养箱中，分别发酵培养0、3、6、9 d。1.2.2黑水虻的孵化与保育将虫卵置于带网纱的开口圆形塑料盒（24 cm×19 cm×8.7 cm，容量2.5 L）中孵化。孵化温度为（28±2）℃，相对空气湿度80%，孵化2 d。将刚孵出的初生幼虫转移至营养料中进行饲养，水分含量为65%~70%，温度（27±2）℃，保育至6日龄幼虫，用于后续试验。营养料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.T001表1营养料组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100.00麦麸50.00粗蛋白21.77豆粕30.00粗脂肪2.52苜蓿草粉20.00粗灰分5.85粗纤维9.11%1.2.3发酵PKM饲养BSFL将不同发酵天数的PKM与麦麸（2∶1）混合放入方形塑料饭盒中（21 cm×14 cm×6.3 cm，容量1.5 L）。向塑料饭盒中投入100只6日龄BSFL，保持总饲养基质为300 g，加入蒸馏水调整水分含量为65%，使用纱网覆盖盒顶防止幼虫爬出，用有孔的盖子盖住。在（28±2）℃，湿度60%~80%的恒温恒湿箱中养殖。每个试验组3个重复。试验期间改变盒子在培养箱中的位置，以消除位置的影响，试验期10 d。1.3测定指标及方法1.3.1发酵PKM的收集PKM发酵0、3、6、9 d后，分别测量pH值，将发酵基质置于105 ℃电热鼓风干燥箱烘干1 h，研磨，冷却，检测营养组成。1.3.2营养成分pH值使用精密pH计按照NY/T 1377—2007测定；可溶性还原糖参考王卫卫[14]的方法，采用紫外分光光度计测定；中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）采用Van-Soest洗涤剂法[15]，采用阿尔瓦F1600半自动纤维仪测定；粗蛋白采用凯式定氮法按照GB/T 6432—2018测定；粗脂肪采用脂肪测定仪按照GB/T 6433—2006测定；粗灰分按照GB 5009.4—2016测定。1.3.3BSFL及饲料收集每2 d收集30只BSFL，测量体重、体长、体宽，饲养10 d后停止试验，将所有幼虫挑出。105 ℃烘干所有虫体及剩余物质。1.3.4BSFL肠道提取第0、5、10 d时，随机挑选黑水虻幼虫，放入带有盖子和纱布的塑料饭盒中进行空腹处理。饥饿24 h，将幼虫取出放在灭完菌的平板上，用75%酒精对虫体表面进行消毒，用无菌水反复冲洗，剪开幼虫尾部，使用镊子将幼虫的肠道取出，置于2 mL的离心管中，放入-80 ℃冰箱保藏。1.3.5BSFL生长性能使用分析天平和数显游标卡尺分别测量BSFL体重、体长、体宽。BSFL存活率=结束时存活条数/投入BSFL条数(1)BSFL获得生物量=BSFL最终总干重-初始总干重(初始总干重≈0)(2)BSFL获得生物量=BSFL最终总鲜重-初始总鲜重(3)BSFL生长率=BSFL获得生物量/饲养时间(4)1.3.6饲料转化消耗饲料总量=初始饲料干重-结束时剩余物质干重(5)消耗饲料转化率=BSFL获得生物量/消耗饲料总量(6)饲料利用率=BSFL获得生物量/添加饲料干重(7)料重比=添加饲料干重/BSFL获得生物量(8)1.3.7BSFL肠道微生物多样性的测定采用Mo Bio/QIAGEN公司DNeasy PowerSoil Kit抽提DNA，用琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。利用正向引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和反向引物806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）对16S rRNA基因V3~V4区域进行PCR扩增。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行预处理，SPSS Statistics 23.0软件进行统计学分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同发酵天数PKM的发酵品质与营养成分2.1.1PKM中还原糖含量和pH值随发酵时间变化情况（见表2）由表2可知，未发酵PKM的初始还原糖含量为0.07 mg/kg。随着发酵进行，PKM的还原糖含量呈先增大后减少的趋势。与未发酵组比，发酵后PKM的还原糖含量分别增加95.43倍、16.85倍、6.57倍。发酵3 d时PKM的还原糖含量最高，显著高于其他组（P0.05）。随着发酵进行，PKM的pH值逐渐降低。发酵0~3 d，PKM的pH值下降速度最快。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.T002表2PKM中还原糖含量和pH值随发酵时间变化情况发酵时间/d还原糖/(mg/kg)pH值00.07±0.00d4.72±0.02a36.75±0.11a4.12±0.02b61.25±0.02b4.10±0.01b90.54±0.02c4.07±0.02c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.1.2PKM中粗蛋白和粗脂肪含量随发酵时间变化情况（见表3）由表3可知，未发酵PKM粗蛋白含量为14.26%。随着发酵时间延长，发酵3、6、9 d的PKM粗蛋白含量分别达到15.81%、17.04%、17.32%。各组PKM的粗脂肪含量差异不显著（P0.05）。研究表明，发酵过程不会引起粗脂肪的损失，有利于改善营养组成。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.T003表3PKM中粗蛋白和粗脂肪含量随发酵时间变化情况发酵时间/d粗蛋白粗脂肪014.26±0.89b6.68±1.23315.81±0.26ab8.71±1.38617.04±0.23a8.96±2.08917.32±1.73a7.72±4.38%2.1.3PKM中NDF和ADF含量随发酵时间变化情况（见表4）由表4可知，PKM初始NDF为50.97%。经过发酵处理后，NDF分别降至29.03%、36.46%、33.73%。NDF降解率分别为43.04%、28.47%、33.82%。发酵处理后，PKM的ADF含量均呈不同程度降低。经过3、6、9 d发酵后，ADF降解率分别为45.89%、9.79%、28.49%。研究表明，发酵能够降解PKM中NDF和ADF，改善PKM的营养价值。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.T004表4PKM中NDF和ADF含量随发酵时间变化情况发酵时间/dNDFADF050.97±0.38a27.48±3.92a329.03±5.16c14.87±5.06b636.46±2.34b24.79±5.12ab933.73±3.07bc19.65±6.47ab%2.2发酵PKM饲养黑水虻2.2.1不同发酵时间PKM对BSFL生长性能的影响（见图1、表5）由图1可知，随着饲养时间的延长，BSFL平均体重、体长和体宽均逐渐增大。使用发酵0、3、6、9 d的PKM饲养BSFL，10头BSFL平均体重分别为2.20、2.87、2.73、2.42 g；体长分别为20.49、22.35、23.44、21.78 mm；体宽分别为4.75、5.69、5.6、5.24 mm。饲养2 d后，BSFL进入暴食期，生长速率增大。与未发酵PKM组比，使用发酵后的PKM能够显著提高BSFL的平均体重、体长及体宽（P0.05）。图1不同发酵时间PKM饲养下BSFL平均体重、体长和体宽10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.F1a1（a）BSFL体重10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.F1a2（b）BSFL体长10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.F1a3（c）BSFL体宽由表5可知，各试验组的BSFL存活率均达到86%以上，表明发酵过程产生的代谢产物不会影响BSFL的成活率。在发酵过程中，BSFL获得生物量在5.7~7.5 g。BSFL获得生物量与BSFL生长率密切相关，均呈先升高后降低的趋势。与未发酵组比，发酵3、6、9 d时BSFL的生物量分别提高29.71%、23.84%、16.41%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.T005表5不同发酵时间PKM对BSFL生长性能影响发酵时间/d存活率/%BSFL获得生物量/gBSFL生长率/(g/d)087.67±0.055.79±0.34d0.58±0.03d388.33±0.027.51±0.39a0.75±0.04a690.34±0.037.02±0.17bc0.70±0.02bc986.00±0.056.74±0.10c0.67±0.01c2.2.2不同发酵时间的PKM对BSFL饲料利用率的影响（见表6）由表6可知，与未发酵组比，发酵3、6、9 d时，BSFL的消耗饲料总量、消耗饲料转化率、饲料利用率、料重比均存在显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.T006表6不同发酵时间的PKM对BSFL饲料利用率的影响发酵时间/d消耗饲料总量/g消耗饲料转化率/%饲料利用率/%料重比054.60±0.36a10.60±0.01b5.51±0.00c4.83±0.14a348.65±0.73b15.44±0.01a7.15±0.00a3.69±0.13c643.90±0.73c15.98±0.00a6.68±0.00ab3.89±0.02c943.64±1.14c15.46±0.01a6.42±0.00b4.40±0.38b与未发酵组比，发酵PKM改善了BSFL的生长状态，饲料转化率、饲料利用率均上升，消耗的饲料总量减少。结果表明，少量的发酵PKM能够提供幼虫丰富的营养，改善幼虫生长性能。与未发酵组比，PKM发酵3、6、9 d时，BSFL饲料转化率分别提高45.66%、50.75%、45.85%，BSFL饲料利用率分别提高29.76%、21.23%、16.52%，料重比分别降低23.60%、19.46%、8.90%。在实际生产中，为控制生产成本和获得最大的经济效益，提高饲料利用率，需要降低料重比[16]。2.2.3不同发酵时间PKM饲养BSFL的营养成分流动（见表7）由表7可知，使用PKM饲养BSFL，BSFL的粗蛋白、粗脂肪及粗灰分含量分别维持在36%、33%、9%以上。与畜禽粪便比，BSFL的蛋白质含量稍低，粗脂肪和粗灰分含量相当，总体上可超过部分BSFL专利饲料[17]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.T007表7不同发酵时间PKM饲养BSFL的营养成分流动组别粗蛋白粗脂肪粗灰分饲养基质虫体剩余物质饲养基质虫体剩余物质饲养基质虫体剩余物质0 d19.20±0.49c42.60±1.78a19.20±0.50b4.51±0.4433.18±1.710.83±1.264.71±.049c12.29±2.978.84±0.11c3 d19.48±0.29c42.63±3.04a22.50±0.91b4.01±0.1433.64±0.361.84±1.028.23±0.18b10.52±0.0311.99±0.04a6 d21.45±0.27a37.76±1.52b26.24±4.50a4.93±0.1535.32±5.932.58±0.918.83±0.58b9.40±0.0711.26±0.10b9 d20.46±0.18b36.34±0.27b20.93±1.71b4.01±1.4833.91±1.841.58±0.199.75±0.24a9.57±0.5611.24±0.28b%研究表明，PKM剩余物质营养成分经发酵处理后，营养水平均在一定程度上有所提高，可进一步开发利用。2.3发酵PKM对BSFL肠道属水平微生物群落的影响（见图2）由图2可知，幼虫肠道初始菌属主要包括肠球菌属（Enterococcus）、普罗维登斯菌属（Providencia）、鞘脂杆菌属（Sphingobacterium）、克雷伯杆菌属（Klebsiella）、芽孢杆菌属（Bacillus）、片球菌属（Pediococcus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus），相对丰度分别为10.60%、14.25%、25.92%、8.08%、4.24%、6.92%、6.75%。相同饲养天数下，发酵组与未发酵组的BSFL肠道主要菌属存在差异。饲养5 d，未发酵组幼虫肠道中，肠球菌属、普罗维登斯菌属、摩根氏菌属（Morganella）、乳杆菌属（Lactobacillus）、产碱杆菌属(Alcaligenes）、芽孢杆菌属（Lysinibacillus）为主要菌属；肠球菌属与产碱杆菌属属于优势菌属，相对丰度分别为35.43%、19.90%。饲养5 d，发酵组幼虫肠道中，肠球菌属相对丰度降低，普罗维登斯菌属、摩根氏菌属相对丰度增加；肠球菌属、普罗维登斯菌属、摩根氏菌属为优势菌属，相对丰度达到20.41%、19.72%、15.46%。饲养10 d，未发酵组主要菌属相对丰度显著降低；发酵组主要菌属与第5 d时相似，但幼虫肠道中普罗维登斯菌属、摩根氏菌属、克雷伯氏菌属、埃希氏杆菌属（Escherichia）相对丰度降低，肠球菌属相对丰度增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.014.F002图2发酵PKM对BSFL肠道属水平微生物群落的影响（丰度取值TOP10）注：B00为初始幼虫肠道样本；B05、B010分别为PKM发酵0 d下饲养黑水虻5、10 d时幼虫肠道；B35、B310分别为PKM发酵3 d下饲养黑水虻5、10 d时幼虫肠道。3讨论3.1不同发酵时间对棕榈仁粕品质的影响由于PKM是一种高纤维的植物性原料，约40%是难以消化的非淀粉性多糖[18]。在实际运用过程中，常需要对PKM进行预处理，如通过物理法膨化[19]、微波、高压或生物法酶解、发酵改善PKM品质。Gomez-Osorio等[20]研究发现，添加β-甘露聚糖酶可以增加PKM中可溶性甘露糖寡糖数量。Firdaus等[21]通过外源添加米根霉ME01发酵PKM，发现PKM发酵后的灰分、蛋白质含量分别增加18.26%、3.45%。本试验中，采用了菌酶结合的方法对PKM进行发酵预处理，结果显示，与未发酵的PKM组比，发酵后PKM的品质得到显著改善，pH值及NDF、ADF的含量显著降低，还原糖和蛋白质含量均有一定程度增加。研究表明，发酵过程中PKM的纤维成分得到降解，产生了还原糖，使整个体系中还原糖含量升高；发酵PKM给微生物带来了更多的碳源，供微生物生长，使乳酸菌利用营养物质产生乳酸、醋酸等有机酸；酵母菌通过与乳酸菌的共生作用刺激乳酸菌活动，促进乳酸菌繁殖，从而导致体系中pH值下降。发酵后PKM蛋白质含量增加的原因可能是酶分解蛋白质释放出结合蛋白；但随着发酵时间增加，发酵体系中营养物质被逐渐消耗，微生物生长逐渐缓慢；发酵时间3 d时，PKM营养物质处于较高水平，能够获得更多的营养物质。因此，PKM的最佳发酵时间为3 d。3.2不同发酵时间的PKM对BSFL生长性能和营养成分的影响本试验中，发酵过程明显提高了BSFL的获得生物量、生长率、饲料利用率及饲料转化率，降低了BSFL的料重比。有研究发现，使用菌粉发酵过的椰子胚乳饲养黑水虻幼虫可使幼虫生物量提高36%，显著缩短黑水虻生命周期[22]。Shanti等[23]研究发现，使用角蛋白酶和蜡样芽孢杆菌的发酵上清液干物质作为饲料养殖BSFL，能够有效提高黑水虻幼虫平均增重，降低料重比、提高存活率。也有研究表明，发酵过程可促进PKM中大分子蛋白质分解为小分子肽，将难以消化的粗纤维分解成寡糖或单糖，更有利于BSFL消化吸收利用[24]。原因可能是发酵过程微生物改善了BSFL肠道的微生物群落组成，调控氨基酸合成与促进代谢产生的营养物质有关。本试验中，发酵过程未能引起BSFL的粗脂肪和粗灰分含量显著变化，但长时间发酵使BSFL粗蛋白的含量呈一定幅度的减少。原因可能是过度发酵造成营养物质损失，从而减少了可供BSFL消化吸收的营养[25]。综合BSFL的生长情况及主要营养成分，发酵时间以3 d较合适。3.3发酵PKM对BSFL肠道微生物多样性影响昆虫肠道内细菌群落的组成和丰度不仅受到昆虫种类的影响，还受到饮食的影响。饮食的改变会导致BSFL在肠道中形成不同的细菌群落[26]。细菌群落会影响机体的营养协调、生理反应、生长寿命。有研究表明，将外源菌接种到鸡粪中能够获得更大的幼虫，减少粪便残留[27]。本试验中，最佳生长性能的BSFL组来自发酵第3 d的PKM，该组BSFL肠道中肠球菌属、普罗维登斯菌属、摩根氏菌属为优势菌属。肠球菌属作为一种常见的有益菌属，随着饲养进行，相对丰度逐渐增加。普罗维登斯菌属、摩根氏菌属能够保护BSFL免受病原体侵害。研究表明，肠球菌属、普罗维登斯菌属、摩根氏菌属极大地促进了BSFL的发育。4结论本研究结果表明，使用发酵方法对PKM进行预处理能够有效改善PKM的饲用品质。发酵第3 d的PKM用于饲养黑水虻幼虫，可提高黑水虻幼虫的生长性能，改善黑水虻幼虫的肠道健康。