乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌发酵饲料一直是研究热点。研究表明，饲料中添加乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌发酵后，动物消化吸收功能得到改善，机体免疫力明显提高[1-3]。鲫鱼是我国重要淡水养殖鱼类，随着其养殖规模扩大和放养密度提高，养殖鲫鱼抗药性增强，终端产品因抗生素残留可能导致食品安全隐患。采用益生菌发酵得到的无抗饲料是解决上述养殖困境的重要途径。目前，养殖生产中常用的发酵菌株包括芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等，可在鱼体消化道内形成优势益生菌群，生长代谢过程中可以生成少量有机酸，从而增加消化道内的酸度，使致病性微生物在酸性环境中的生长受到抑制[4]。此外，饲料原料发酵后可在一定程度上提高蛋白或粗脂肪的水平，并且降低其中抗营养因子浓度[5-6]。有研究显示，发酵饲料可适度替代鱼粉，对大口黑鲈、大黄鱼等生长性能、消化、免疫无显著影响，还能够大幅度减少鱼粉的用量[7-9]。目前，水产饲料发酵所用益生菌多为陆源性[10]，而水源性发酵菌应用报道较少[11]。因此，本试验采用水体分离的乳酸菌和酵母菌对豆粕进行固态发酵，测定其营养价值、活菌数等指标，再将发酵豆粕添加到饲料中投喂鲫鱼，测定鲫鱼生长性能、肌肉品质、健康状况等指标，综合评价试验菌发酵豆粕饲料应用效果，为试验菌应用于鲫鱼养殖生产提供参考。1材料与方法1.1发酵豆粕制备试验所用豆粕（中粮集团有限公司）的水分≤13%、粗蛋白≥44.0%、粗脂肪≤2.0%、粗灰分≤7%、粗纤维≤7%，粉碎过60目筛。发酵菌种由江苏海洋大学抗菌微生物及其代谢产物研究与应用重点实验室提供。将豆粕水分调节为37%，装入锥形瓶中灭菌，采用高温高压灭菌处理（121 ℃、0.5 MPa灭菌15 min）。灭菌后豆粕放入超净工作台用密封袋分装成4份，以不接种菌液为对照组（CT），设置乳酸菌发酵组（LAB，每千克豆粕接种2.88×109 CFU/mL乳酸菌菌液40 mL）、酵母菌发酵组（YE，每千克豆粕接种2.96×109 CFU/mL酵母菌菌液40 mL）和混合菌液发酵组（LAB-YE，每千克豆粕接种20 mL乳酸菌+20 mL酵母菌菌液）。接种后放入恒温培养箱培养（28 ℃），发酵3 d。发酵后，放入4 ℃冰箱保存。1.2发酵豆粕细菌总数测定和营养成分分析使用蒸馏水将发酵豆粕稀释，按梯度分别涂布在相应固体培养基上，参照国家标准GB 13093—91计算各培养基中细菌总数。发酵豆粕中粗蛋白含量采用凯氏定氮法（FOSS KjeltecTM-8400凯氏定氮仪，丹麦福斯公司）测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法（FOSS SoxtecTM8000脂肪测定仪，丹麦福斯公司）测定；粗灰分含量采用550 ℃灼烧称量法（GB 5009.4—2016）[12]测定。1.3试验饲料以蛋白含量为35%的基础饲料为对照组（CT组），将对照组饲料中的豆粕完全替换为乳酸菌发酵豆粕（LAB组）、酵母菌发酵豆粕（YE组）以及混合菌发酵豆粕（LAB-YE组），共配置4组等氮饲料。饲料组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T001表1饲料组成及营养水平（干物质基础）项目CT组LAB组YE组LAB-YE组原料组成鱼粉6.006.006.006.00豆粕22.50000发酵豆粕022.5022.5022.50花生粕15.0015.0015.0015.00棉粕20.6020.6020.6020.60面粉28.0028.0028.0028.00磷酸二氢钙1.701.701.701.70胆碱（50%）0.300.300.300.30豆油5.005.005.005.00多维0.400.400.400.40多矿0.500.500.500.50合计100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白35.4435.1435.9835.76粗脂肪8.118.138.338.15粗灰分8.238.538.588.41水分10.2610.5310.3210.18注：1.多维、多矿购自盐城百诺生物科技有限公司。2.营养水平均为计算值。%1.4试验设计及饲养管理试验所用鲫鱼初始平均体重为（14.61±0.12）g，购自连云港市博旺特种水产养殖有限公司。暂养1 w后，选取360尾规格均匀的健康鲫鱼，随机分为4组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。各组鲫鱼投喂相应的试验饲料。鲫鱼每天投喂4次，每日投喂量为体重的3%，每周根据体重增长情况调整一次投喂量。养殖期间水温为25 ℃，溶氧≥5 mg/L，pH值7.7~8.2，氨氮＜0.2 mg/L。试验期为8 w。1.5测定指标及方法1.5.1样品采集养殖试验结束后，将试验鱼饥饿24 h后进行计数、称重，测定增重率等生长指标。每缸随机取6尾鱼解剖，计算脏体比。取部分肝胰脏组织和1 cm中肠，放入4%多聚甲醛中固定，用于组织切片观察。随机取3尾鱼背鳍与侧线间肌肉，置于密封袋中，-80 ℃冰箱保存，用于测定肌肉中常规营养成分以及氨基酸和脂肪酸的含量。1.5.2生长性能成活率(SR)=n1/n2×100%(1)饲料系数(FCR)=m1/(m3-m2)(2)增重率(WGR)=(m3-m2)/m2×100%(3)蛋白质效率比(PER)=(m3-m2)/(m1×P)×100%(4)特定生长率(SGR)=(lnm3-lnm2)/t×100%(5)脏体比(VSI)=m4/m3×100%(6)肥满度(CF)=m3/L3×100%(7)式中：n1、n2分别为试验开始和结束时鲫鱼的数量（尾）；m1为饲料总摄食量（g）；m2、m3分别为鲫鱼的初重（IBW，g）和末重（FBW，g）；m4为鲫鱼内脏重（g）；t为养殖时间（d）；P为鲫鱼肌肉粗蛋白含量（%）；L为鲫鱼体长（cm）。1.5.3肌肉常规营养组分、氨基酸和脂肪酸含量肌肉常规营养组分测定方法见1.2，氨基酸含量用Hitachi L-8900日立氨基酸分析仪（日本株式会社）测定，脂肪酸含量采用岛津GC-MS 2010 SE气相色谱质谱联用仪（日本株式会社）测定。采用FAO（2011）成人必需氨基酸理想模式计算氨基酸评分（AAS）。ASS=待评蛋白质氨基酸含量（mg/g N）/FAO评分模式氨基酸含量（mg/gN）（8）1.5.4中肠和肝脏组织形态观察使用4%多聚甲醛固定好的鲫鱼中肠和肝脏样品送至Servicebio有限公司（武汉），制作石蜡切片，并进行H&E染色，观察中肠和肝脏的组织变化。1.6数据统计与分析数据利用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同菌液发酵后豆粕中活菌数和常规营养成分（见表2、表3）由表2可知，LAB组1 g豆粕活菌数为3.08×108 CFU，YE组1 g豆粕的活菌数为3.19×108 CFU，LAB-YE组1 g豆粕的活菌数为3.12×108 CFU。发酵后3组豆粕中活菌数无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T002表2不同菌液发酵后豆粕中活菌数项目CT组LAB组YE组LAB-YE组活菌数03.08×1083.19×1083.12×108CFU/g由表3可知，与CT组相比，LAB组、YE组和LAB-YE组中粗蛋白和粗灰分含量均无显著变化（P0.05），但粗脂肪含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T003表3不同菌液发酵后豆粕中常规营养成分组别粗蛋白粗脂肪粗灰分CT组50.14±0.430.41±0.02b6.90±0.07LAB组50.86±0.330.63±0.03a6.88±0.05YE组50.89±0.370.61±0.04a6.85±0.06LAB-YE组50.95±0.060.69±0.02a6.91±0.06注：同列数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4~表7与此同。%DM2.2发酵豆粕饲料对鲫鱼生长性能的影响（见表4）由表4可知，各组鱼体WGR、PER、FCR、SGR、VSI和CF差异均不显著（P0.05），SR均为100%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T004表4发酵豆粕饲料对鲫鱼生长性能的影响组别IBW/gFBW/gWGR/%FCRPER/%SGR/(%/d）SR/%VSI/%CF/%CT组14.61±0.1243.97±0.91200.85±4.791.28±0.042.98±0.121.83±0.04100.009.46±0.351.82±0.08LAB组14.53±0.1244.18±1.20204.08±10.571.27±0.063.00±0.151.87±0.03100.009.57±0.561.79±0.30YE组14.60±0.1044.20±0.68202.74±5.401.27±0.032.99±0.011.85±0.01100.009.43±0.491.81±0.23LAB-YE组14.64±0.1042.36±0.60189.33±5.501.30±0.032.77±0.241.78±0.05100.009.36±0.481.76±0.282.3发酵豆粕饲料对鲫鱼常规营养成分的影响（见表5）由表5可知，LAB-YE组鱼体肌肉粗蛋白含量显著高于CT组、LAB组和YE组（P0.05）。LAB组和YE组鱼体肌肉粗脂肪含量均显著高于LAB-YE组和CT组（P0.05），LAB-YE组与对照组差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T005表5发酵豆粕饲料对鲫鱼肌肉常规营养组分的影响组别粗蛋白/%DM粗脂肪/%DM粗灰分/%DM水分/%CT组87.42±0.63b7.37±0.21b3.45±0.0978.33±0.20LAB组87.91±0.32b8.81±0.21a3.50±0.1478.05±0.50YE组87.92±0.49b8.73±0.20a3.49±0.1677.78±0.48LAB-YE组89.22±0.31a7.01±0.21b3.50±0.0677.94±0.382.4发酵豆粕饲料对鲫鱼肌肉氨基酸和脂肪酸含量的影响（见表6~表8）由表6可知，与CT组相比，LAB组、YE组以及LAB-YE组鱼体肌肉各种氨基酸的含量差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T006表6发酵豆粕饲料对鲫鱼肌肉氨基酸含量的影响组别呈味氨基酸必需氨基酸总氨基酸CT组21.02±0.6029.82±0.9758.29±1.17LAB组20.73±0.4429.72±0.7357.73±1.91YE组20.60±0.5029.66±0.6157.38±1.22LAB-YE组21.08±0.4530.31±0.9258.85±1.19%DM由表7可知，CT组、LAB组、YE组LAB-YE组鱼体肌肉氨基酸评分依次为12、13、13、13，第一限制氨基酸均为组氨酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T007表7鲫鱼肌肉必需氨基酸评分组别赖氨酸苏氨酸缬氨酸蛋氨酸+半胱氨酸异亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸+酪氨酸组氨酸CT组1391487139787987312*LAB组1371467038886967513*YE组1361457038685957413*LAB-YE组1371457139886967413*注：“*”表示第一限制氨基酸，即氨基酸评分（AAS）。由表8可知，与CT组相比，LAB组、YE组和LAB-YE组鱼体肌肉SFA、MUFA以及PUFA含量均无显著差异（P0.05），但三组鱼体肌肉DHA含量均显著高于对照组（P0.05），且LAB-YE组含量最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.T008表8发酵豆粕饲料对鲫鱼肌肉脂肪酸含量的影响项目CT组LAB组YE组LAB-YE组饱和脂肪酸（SFA）C14∶02.01±0.02a2.04±0.03a1.98±0.06a1.77±0.02bC16∶039.24±0.3839.36±0.2039.22±0.1439.38±0.26C18∶010.53±0.2410.49±0.2911.42±0.1910.97±0.16单不饱和脂肪酸（MUFA）C16∶11.50±0.01a1.42±0.01a1.39±0.03a1.19±0.03bC18∶1n-9c20.92±0.1320.44±0.1320.87±0.2120.11±0.20C20∶1n-91.09±0.02b1.15±0.02a1.17±0.01a1.00±0.00bC22∶1n-90.25±0.01a0.26±0.01a0.22±0.03b0.20±0.04b多不饱和脂肪酸（PUFA）C18∶2n-6c20.20±0.4320.19±0.2619.34±0.1419.91±0.19C18∶3n-32.11±0.092.06±0.012.02±0.051.91±0.07C20∶4n-60.72±0.09c1.05±0.02b0.86±0.05c1.41±0.07aC20∶5n-3（EPA）0.29±0.02b0.31±0.01b0.32±0.01b0.38±0.02aC22∶6n-3（DHA）0.95±0.08c1.22±0.04b1.18±0.05b1.76±0.12aΣSFA51.78±0.4351.89±0.4052.62±0.2952.12±0.84ΣMUFA23.76±0.1623.27±0.1423.65±0.2622.50±0.24ΣPUFA24.27±0.3624.83±0.1723.72±0.1625.37±0.35Σn-3 PUFA3.35±0.12b3.59±0.06ab3.52±0.06ab4.05±0.21aΣn-6 PUFA20.92±0.3621.24±0.9020.20±0.1421.32±0.16Σn-3/Σn-60.16±0.01b0.17±0.01b0.17±0.01b0.19±0.01a注：同行数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或者无字母表示差异不显著（P0.05）。%DM2.5发酵豆粕饲料对鲫鱼中肠和肝脏健康状况的影响（见图1、图2）鲫鱼中肠放大200倍，观察肠道组织结构。由图1可知，CT组鱼体肠道组织皱襞结构完整，可见杯状细胞分布，黏膜下层可见少量淋巴细胞浸润（黄色箭头）；LAB-YE组鱼体肠道组织各层结构清晰，黏膜上皮完整，可见杯状细胞分布，黏膜下层未见明显的炎性细胞浸润肌层肌细胞排列整齐；YE组鱼体肠道组织皱襞结构完整，可见杯状细胞分布，黏膜下层可见少量淋巴细胞浸润（黄色箭头）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.F001图1发酵豆粕饲料对鲫鱼中肠组织结构的影响（200×）由图2可知，CT组鲫鱼肝细胞呈现少量的空泡变性，细胞肿大，胞质内出现大小不等的圆形空泡（黑色箭头），胞核被挤到一边（见红色箭头）；3个试验组肝细胞形态结构未见明显异常。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.010.F002图2发酵豆粕饲料对鲫鱼肝脏组织结构的影响（200×）3讨论3.1乳酸菌和酵母菌发酵对豆粕常规营养成分的影响有研究表明，豆粕经微生物发酵，粗蛋白、粗脂肪等常规营养成分的含量均有所提升[13]。李杰等[14]研究表明，豆粕经微生物发酵后粗脂肪含量显著提高。本试验中，豆粕经乳酸菌和酵母菌发酵，粗脂肪含量明显升高，与上述研究结果一致。推测试验菌在以豆粕为发酵底物过程中，可通过乙酰CoA羧化酶催化的羧化反应，经过多次链延长和去饱和作用产生油脂，提高发酵产物中粗脂肪含量[15-16]。3.2发酵豆粕饲料对鲫鱼生长性能的影响现有研究表明，经益生菌发酵后的饲料营养均衡，可促进水产动物的消化和吸收，改善水产动物生长性能，提高存活率。如使用发酵饲料饲喂花鳅（Cobitis taenis）[17]、刺参（Apostichopus japonicus）[18]等均可提高动物生长性能和存活率。张来荣等[19]研究发现，发酵饲料喂养的克氏原螯虾增重率、特定生长率以及存活率与对照组相比并无明显变化。本试验中，发酵饲料对鲫鱼生长性能和存活率无显著影响，可能与养殖周期较短有关（仅8 w）。长期养殖后，试验饲料是否对鲫鱼生长与存活率存在影响需要后续进行试验验证。3.3发酵豆粕饲料对鲫鱼肌肉常规营养成分的影响鱼类肌肉的营养成分在特定生长发育阶段相对稳定，但会随着饲料组成、养殖水环境、疾病等外界因素的改变而发生变化[20]。鱼肉中蛋白质和脂肪含量直接反映其营养价值。陈启亮等[21]发现，投喂斑点叉尾鮰（Ictalurus punctatus）发酵饲料后能够提高鱼体肌肉粗蛋白含量。本试验中，饲料中添加单一菌株发酵豆粕后，养殖鲫鱼肌肉中粗蛋白含量无明显变化，但投喂混合菌发酵饲料后，鱼体肌肉粗蛋白含量明显提升。推测其原因是复合菌株比单一菌株能够更好地定植于肠道，平衡肠道环境，促进蛋白质的消化和利用[22]。本试验中，饲料中添加单一乳酸菌或酵母菌发酵豆粕后，鲫鱼肌肉中粗脂肪积累水平显著高于混合菌发酵组，推测两种菌之间可能存在协同作用，从而促进脂肪代谢以及转换成脂肪酸的能力，降低粗脂肪在鱼肉中积累[23-24]。3.4发酵豆粕饲料对鲫鱼肌肉中脂肪酸含量的影响微生物通过发酵可将脂肪转化成脂肪酸。本试验中，乳酸菌和酵母菌混合组发酵饲料较单一菌组显著提高了n-3 PUFA含量，与史东杰等[24]在锦鲤中的研究结果相似。DHA（c22∶6n-3）和EPA（c20∶5n-3）是动物体内具有重要生理功能的n-3系长链多不饱和脂肪酸，具有运输细胞膜物质、调控基因以及调节渗透压等重要生理功能[25]。钟云飞等[26]对大鳞鲃的研究表明，发酵豆渣可显著提高DHA含量。本试验中，饲料中添加乳酸菌和酵母菌发酵均能够提高鲫鱼肌肉中DHA的含量，与上述结果相似。有研究表明，DHA和EPA能够提高鱼类脂肪代谢能力和免疫性能，从而影响鱼类机体健康[27]。试验鱼肠道和肝脏组织切片结果进一步支持此论断。3.5发酵豆粕饲料对鲫鱼肠道和肝胰脏组织形态的影响本研究中，试验组鱼体肠道黏膜下层淋巴细胞数量明显减少，杯状细胞数量增多，肠道健康得到改善；试验组鱼体肝细胞胞质空泡化也较少，表明试验菌发酵饲料能够改善鲫鱼肠道和肝脏的健康状况。相似结果在大菱鲆[28]、草鱼[29]中均有报道。发酵饲料可改善鱼体健康状况可能与肠道菌群有关，饲料经发酵后产生的有机酸、菌体活性蛋白、叶酸以及益生菌等物质，能够有效改善动物的消化道微生态环境，促进消化酶分泌[30]，从而提高机体的肠道消化酶活性，提高对营养物质的吸收利用。4结论发酵豆粕饲料显著提高了养殖鲫鱼肌肉中粗蛋白、EPA、DHA以及n-3 PUFA的含量，可缓解鱼体肝脏的空泡化现象，提升肠道健康。混合菌发酵饲料养殖效果优于单一菌株发酵饲料。