饲料原料价格上涨会影响养殖利润，因此养殖企业有必要寻找新的成本较低的饲料原料[1-2]。微生态制剂中的枯草芽孢杆菌能够产生大量的蛋白酶、淀粉酶及其他有益因子，直接或间接增强动物的抗氧化能力[3-4]。发酵饲料主要通过微生物的生长代谢作用产生一些活性物质并作用于发酵底物，将大分子物质分解为更易被动物体吸收的小分子物质，从而提高饲料的利用率[[5]。发酵饲料的底物主要包括豆粕、麦麸等。豆粕作为蛋白质饲料，具有适口性好、营养价值高等特点[6]。麦麸可增强动物的免疫功能，促进动物消化和吸收营养[7]。银杏叶渣含有酚类、黄酮类和甾类等多种活性物质[8]，对动物机体的代谢均具有一定的影响。因此，本试验利用益生菌固态发酵技术，以银杏叶渣和豆粕复配物作为基质，把底物分解成具有抗氧化活性的物质，探究各抗氧化指标之间的相关性，为生产微生物发酵蛋白饲料提供一定参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌株与试剂枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）ZM-16经理化诱变选育而得，活菌数为11.5 lgCFU/g，保藏于微生物遗传育种实验室。槲皮素、染料木素、大豆苷、大豆苷元、山柰素均为标准品，购自北京索莱宝科技有限公司。1.1.2培养基LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L，pH值7.0，121 ℃灭菌20 min。1.1.3仪器与设备Biotek SynergyH1多功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，T10紫外分光光度计购自北京普析通用仪器有限责任公司，iChrom 5100高效液相色谱仪购自大连依利特分析仪器有限公司。1.2试验方法1.2.1菌种活化将保藏于甘油管中的枯草芽孢杆菌ZM-16接种于100 mL的LB液体培养基中，37 ℃、120 r/min培养24 h。吸取一活菌悬液0.8 mL，接入100 mL LB液体培养基中，37 ℃、120 r/min培养24 h。1.2.2固态发酵发酵基质配方见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.T001表1发酵基质配方配比基质组成A96%豆粕+4%麦麸B94%豆粕+4%麦麸+2%蒜皮C94%豆粕+4%麦麸+2%银杏叶渣D94%豆粕+4%麦麸+1%蒜皮+1%银杏叶渣按照表1中的配比取不同比例豆粕、麦麸、银杏叶渣、大蒜皮，10 g基质，加10 mL纯水，基质灭菌后接入4%菌种（0.8 mL），混匀，37 ℃培养，每隔12 h摇晃1次，发酵72 h。0 h为对照组，接菌后于-20 ℃保藏。样品发酵完毕后，与0 h对照组一起冷冻干燥，使用研钵研磨成粉末状，-20 ℃保藏。1.2.3饲料配比的确定测定A、B、C、D发酵基质配方的发酵前、后样品的DPPH自由基清除率和羟自由基清除率，确定最优的饲料配比。1.2.4发酵时间的确定在最优饲料配比条件下，测定发酵0，6、12、24、36、48、54、60、66、72、78、84 h样品的DPPH自由基清除率和羟自由基清除率，确定最优发酵时间。1.2.5样品准备5 g冻干后样品加入50 mL 80% 乙醇，50 ℃、4 h适当摇晃。提取液放入50 mL离心管，4 ℃、8 000 r/min离心15 min，收集上清液。残余固体继续加入50 mL 80%乙醇，50 ℃提取4 h，收集上清液。使用旋转蒸发仪对上清液浓缩，温度60 ℃，100 r/min，浓缩液冻干保存。将上述提取后得到的样品配制成5 g/L的母液，配制好的母液稀释为2、4、6、8、10倍5个浓度梯度。1.2.6体外抗氧化活性分析1.2.6.1DPPH自由基清除率DPPH自由基清除率的测定参考文献[9]，以0~2.5 g/L的VC作为阳性对照。DPPH清除率=(1- A样品-A'A空白)×100%(1)式中：A样品为样品+DPPH溶液反应所测吸光度；A'为样品+80%乙醇反应所测吸光度；A空白为80%乙醇+DPPH溶液所测吸光度。1.2.6.2羟自由基清除活性的测定羟自由基清除率测定参考文献[10]，以0~2.5 g/L的VC作为阳性对照。羟自由基清除率=(1- Ax-Ax0A空白-A0)×100%(2)式中：Ax为样品+FeSO4溶液+水杨酸溶液+H2O2溶液反应所测的吸光度；Ax0为去离子水代替H2O2溶液反应所测的吸光度；A空白为80%乙醇溶液代替样品溶液反应所测的吸光度；A0为80%乙醇溶液代替样品溶液、去离子水代替H2O2溶液反应所测的吸光度。1.2.6.3铁离子还原能力采用FRAP法[11]测定样品提取液的铁离子还原力，根据标准曲线拟合的回归方程，计算被测样品的硫酸亚铁的物质的量浓度（μmoL/L）。1.2.6.4超氧阴离子自由基清除率超氧阴离子自由基清除率的测定参考文献[11]，以0~2.5 g/L的VC作为阳性对照。超氧阴离子自由基清除率=(A0-AxA0)×100%(3)式中：Ax为样品+Tris-HCl缓冲液+邻苯三酚溶液+HCl溶液所测的吸光度；A0为80%乙醇溶液代替样品溶液反应所测的吸光度。1.2.7抗氧化成分含量1.2.7.1总酚含量总酚含量测定采用福林酚法[12]，以没食子酸（GA）为标准品绘制标准曲线，样品相当于没食子酸的当量浓度，以mg GAE/g提取物表示。1.2.7.2总黄酮含量在10 mL离心管中依次加入2 mL样品溶液、0.3 mL 5% NaNO2，振荡摇匀，静置6 min，加入0.3 mL 10% Al(NO3)3，摇匀静置6 min，加入30% NaOH，静置15 min。于510 nm处测定吸光度，利用80%乙醇代替样品作为空白对照。以芦丁为参照品，配制不同浓度芦丁标准品溶液，测定吸光值，绘制出芦丁标准曲线，通过标准曲线计算提取物中黄酮含量。1.2.7.3大豆异黄酮含量参考鲍会梅[13]的方法测定染料木苷、大豆苷元、染料木素，色谱条件为：色谱柱Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为40%甲醇∶60%水（纯水∶醋酸=40∶1），柱温40 ℃，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，检测波长259 nm。1.2.7.4山柰素含量参考杨金鑫等[14]的高效液相色谱法测定山柰素，色谱条件为：色谱柱Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为45%甲醇∶65%纯水，柱温25 ℃，流速0.8 mL/min，进样量20 μL，检测波长370 nm。1.2.7.5样品发酵前后半最大效应浓度（EC50值）EC50值代表清除率达到50%时样品的浓度。使用SPSS软件计算所测样品提取溶液DPPH自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子清除率的EC50值，选择回归分析中的PROBIT方法，最高清除选择100%，建立概率单位模型方程，根据建立的方程，求得样品发酵前后的EC50值。1.3数据统计与分析试验结果为3次重复结果的平均值，试验数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。采用IBM SPSS Statistics 23软件进行主成分分析、相关分析并检验相关系数的显著性。2结果与分析2.1复配饲料最佳配比的确定2.1.1发酵前后饲料的DPPH自由基清除率的变化（见图1）由图1可知，经过72 h发酵，4种配方饲料DPPH自由基的清除率均明显提升，其中配方C（94%豆粕+4%麦麸+2%银杏叶渣）抗氧化能力提升最高，DPPH自由基清除率从25.23%提高至60.06%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F001图1发酵前后饲料的DPPH自由基清除率的变化2.1.2发酵前后饲料的羟自由基清除率的变化（见图2）由图2可知，经过72 h发酵，4种配方饲料羟自由基的清除率明显提升，其中配方C对羟自由基清除率提升最高，从25.21%提高至69.56%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F002图2发酵前后饲料的羟自由基清除率的变化综合图1与图2结果可知，经过72 h发酵，饲料的抗氧化性能均有所提升，发酵饲料对DPPH自由基清除率排序为CBDA，发酵饲料对羟自由基清除率排序CABD，配方C的两项抗氧化活性始终最高，因此选择最优配方C（94%豆粕+4%麦麸+2%银杏叶渣）进行后续试验。2.2最优发酵时间的确定2.2.1发酵时间对发酵饲料DPPH自由基清除率的影响（见图3）由图3可知，枯草芽孢杆菌发酵饲料DPPH自由基清除率从最开始的14.00%逐步上升，66 h达到峰值，其最高值为65.65%，66 h后清除率有所下降，但与未发酵样品相比清除率明显提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F003图3发酵时间对发酵饲料DPPH自由基清除率的影响2.2.2发酵时间对发酵饲料羟自由基清除率的影响（见图4）由图4可知，枯草芽孢杆菌发酵饲料的羟自由基清除率与DPPH自由基清除率的变化情况相似，从未发酵时的26.97%逐步上升，在66 h达到最高值，为63.57%，66 h后清除率有所下降，与未发酵的样品相比清除率也呈明显提高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F004图4发酵时间对发酵饲料羟自由基清除率的影响综合图3与图4结果可知，饲料经过发酵后抗氧化性能均有所提升，发酵时间为66 h的样品所测得的DPPH自由基清除率与羟自由基清除率均为最高值，由此确定发酵时间为66 h。2.3发酵前后饲料的抗氧化性能对比2.3.1不同样品质量浓度对DPPH自由基清除率的影响（见图5）由图5可知，当质量浓度为2.5 g/L时，发酵饲料的DPPH自由基清除率达到56.20%，未发酵为33.39%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F005图5不同样品质量浓度对DPPH自由基清除率的影响2.3.2不同样品质量浓度对羟自由基清除率的影响（见图6）由图6可知，当质量浓度为2.5 g/L时，发酵饲料的羟自由基清除率达到63.45%，未发酵为36.66%。随着样品质量浓度增加，发酵饲料的羟自由基清除率均明显提升，而未发酵的样品提高不明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F006图6不同样品质量浓度对羟自由基清除率的影响2.3.3不同样品质量浓度对铁离子还原能力的影响（见图7）由图7可知，样品质量浓度为2.5 g/L时，发酵饲料铁离子还原力为607.68 µmol/L，未发酵饲料为213.68 µmol/L。发酵饲料提取物铁离子还原能力显著提升，而未发酵的总还原力基本没有提升，铁离子还原力提高可能与发酵过程中铁离子螯合物的释放有关[15]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F007图7不同样品质量浓度对铁离子还原能力的影响2.3.4不同样品质量浓度提取物对超氧阴离子自由基清除率的影响（见图8）由图8可知，样品质量浓度为2.5 g/L时，发酵后超氧阴离子清除率达到72.95%，未发酵为43.25%。随着浓度增加，发酵后样品提取物超氧阴离子自由基清除率明显提升，未发酵的清除率有所提升，但明显低于发酵后样品。与未发酵饲料相比，发酵饲料具有更强的超氧阴离子自由基清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F008图8不同样品质量浓度对超氧阴离子自由基清除率的影响2.4发酵前后饲料抗氧化功能性成分变化2.4.1芦丁标准曲线结果（见图9）由图9可知，芦丁标准曲线为y=0.002 4x+0.000 8，R2=0.999 7，线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F009图9芦丁标准曲线结果2.4.2发酵前后饲料总酚与总黄酮含量变化（见表2）由表2可知，未发酵饲料提取物中总酚含量为5.48 mg/g，发酵后饲料提取物中总酚含量为12.75 mg/g，是发酵前的2.33倍。未发酵的饲料提取物中总黄酮的含量为12.75 mg/g，经过66 h发酵，总黄酮含量提高至31.64 mg/g，提高了2.40倍。这可能是由于微生物发酵使结合型酚类物质与黄酮物质被释放，使游离酚类化合物与黄酮类化合物含量显著提高[16]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.T002表2发酵前后饲料总酚与总黄酮含量变化项目发酵前发酵后总酚5.48±0.0512.75±0.30总黄酮13.20±0.5231.64±0.42mg/g2.4.3大豆异黄酮含量测定结果大豆异黄酮各个标准品的出峰时间与回归方程及拟合度见表3。发酵前后饲料样品提取液3种大豆异黄酮含量见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.T003表3各标准品出峰时间与回归方程项目出峰时间/min回归方程R2染料木苷4.27y=65.217x-296.540.996 9大豆苷元6.81y=99.735x-431.720.997 4染料木素8.77y=99.425x-170.381.000 010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.T004表4发酵前后的样品提取物3种异黄酮含量项目发酵前发酵后染料木苷5.893.83大豆苷元1.163.38染料木素0.591.82mg/g由表4可知，发酵前样品提取物中的染料木苷、大豆苷元、染料木素含量分别为5.89、1.16、0.59 mg/g。样品提取物中染料木苷为3.83 mg/g，减少35%；大豆苷元与染料木素分别为3.38、1.82 mg/g，比原来提高了2.91倍、3.08倍。通过枯草芽孢杆菌发酵将饲料中的染料木苷与大豆苷分解为染料木素与大豆苷元，分解出的染料木素与大豆苷元均能够显著提高抗氧化活性。2.4.4山柰素含量测定结果根据标准品得知山柰素出峰时间为10.67 min，所得的标准品浓度与峰面积线性回归方程为y=24.445x-316.21，R2为0.990 1。在同样的液相条件下对发酵前后的样品提取液（5 g/L）进行分析，发酵前样品提取物中山柰素含量为0，发酵后山柰素含量为3.04 mg/g。山柰素含量提高可能是因为枯草芽孢杆菌发酵将银杏叶中黄酮醇苷分解转化为山柰素等黄酮醇类，从而提升饲料抗氧化活性。2.5样品发酵前后半最大效应浓度（EC50值）（见表5）样品抗氧化能力与EC50密切相关，比较发酵前后样品提取液EC50值，发酵后EC50值降低越多，表明抗氧化能力提高程度越高。由表5可知，在95%的置信区间，发酵后饲料DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子清除的EC50值分别降低了50.44%、62.06%、62.75%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.T005表5发酵前后浸提物抗氧化指标的EC50项目发酵前发酵后DPPH自由基4.50±0.282.23±0.26羟自由基3.98±0.251.51±0.23超氧阴离子2.04±0.250.76±0.24g/L2.6抗氧化能力与抗氧化活性物质的相关性分析（见表6）由表6可知，总酚含量与不同抗氧化能力的相关性排序为超氧阴离子清除率铁离子还原能力羟自由基清除率DPPH自由基清除率（P0.01）；总黄酮含量与不同抗氧化能力的相关性排序为铁离子还原能力羟自由基清除率超氧阴离子清除率DPPH自由基清除率（P0.01）。其中总黄酮的含量与抗氧化性能的相关性比较大，普遍高于总酚与抗氧化性能的相关性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.T006表6抗氧化能力与抗氧化活性物质的相关性分析项目DPPH自由基清除率羟自由基清除率超氧阴离子清除率铁离子还原能力总酚0.616**0.737**0.827**0.742**总黄酮0.896**0.967**0.827**0.984**注：“**”表示在0.01水平上显著相关。2.7样品的抗氧化性能主成分分析（见表7、图10）由表7可知，对浸提物6个抗氧化指标进行主成分降维后提取了两个主成分，这两个主成分累积贡献率达到95.368%，能够正确反映抗氧化指标的整体信息。其中，第一个主成分的贡献率为87.173%，能够表达的因子为5.230；第二个主成分的贡献率为8.195%，能够表达的因子为0.492。由表7初始主成分矩阵旋转后得到图10。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.T007表7主成分特征值及贡献率测定结果项目初始特征值提取载荷平方合计因子贡献率/%累计贡献率/%合计因子贡献率/%累计贡献率/%15.23087.17387.1735.23087.17387.17320.4928.19595.3680.4928.19595.36830.2203.67499.04240.0450.74399.78650.0120.19599.98060.0010.020100.00010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.015.F010图10样品的抗氧化主成分分析注：A为DPPH自由基清除率，B为羟自由基清除率，C为超氧阴离子清除率，D为铁离子还原力，E为总酚含量，F为总黄酮含量。由图10可知，DPPH自由基清除率、羟自由基清除率、超氧阴离子清除率、铁离子还原力、总酚、总黄酮与PC1均呈正相关，超氧阴离子、总酚与PC2呈正相关，DPPH自由清除率、羟自由基清除率、铁离子还原力、总黄酮与PC2呈负相关。各个指标相距较近，表明所测6项指标相关性均很高，与上述所得的两类相关性相一致。3讨论由于不同体外抗氧化模型理论基础不同，单个抗氧化模型难以反映样品整体抗氧化性能。本研究采用4个指标衡量豆粕、麦麸、银杏叶渣复配饲料发酵前后抗氧化性能变化。研究表明，发酵后饲料DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子清除率以及铁离子还原能力较发酵前均显著提高，前3个指标EC50值也显著降低，表明经益生菌枯草芽孢杆菌发酵能够提高复配饲料抗氧化性能。刘宏等[17]采用贝莱斯芽孢杆菌CAU263固体发酵农业副产物瓜尔豆粕，发酵后总酚及DPPH自由基清除率分别比未发酵瓜尔豆粕分别提高了3.9倍和1.5倍。本研究中，经枯草芽孢杆菌发酵饲料中总酚含量是发酵前的2.33倍，总黄酮含量是发酵前的2.40倍。相关性和主成分分析表明，总酚和总黄酮与抗氧化性能具有较好的相关性。研究表明，经微生物发酵，在酶作用下，束缚于不溶性纤维类物质上的酚类物质可被释放到发酵基质中，从而提高发酵基质抗氧化活性[18]。豆粕中含有大量大豆异黄酮[19]，包括游离型苷元和结合型糖苷两类12种，如大豆苷、大豆苷元、染料木素等[20]。银杏叶中含有丰富黄酮成分，包括黄酮醇及其苷类、儿茶素类黄酮[21]。这些成分均具有良好抗氧化、抗癌等功能，能够有效清除机体内各种自由基。本研究表明，经枯草芽孢杆菌发酵后，样品提取物中染料木苷降低了35%；大豆苷元与染料木素分别提高到原来的2.91倍、3.08倍；且山柰素含量由0上升至3.04 mg/g。因此，复配饲料发酵后，大豆异黄酮由结合型糖苷转化为游离型苷元形式；黄酮醇苷分解转化为山柰素等黄酮醇类。研究发现，发酵过程中，由于微生物β-葡萄糖苷酶活性变化使基质中苷元含量上升，而苷元型的大豆异黄酮比其糖苷型具有更好的抗氧化性能[22]。在复配饲料发酵过程中还可能产生具有还原力的氨基酸、小肽、抗氧化维生素和乳酸等，均有利于自由基清除[23]。后续可检测这些指标的变化并进行动物饲喂试验，以探究其对动物体抗氧化性能的影响，更好地评价发酵复配饲料的功能。4结论本研究结果表明，配比为94%豆粕、4%麦麸、2%银杏叶渣，发酵66 h后样品提取液抗氧化活性指标均较发酵前有较大幅度提升；发酵饲料中总酚、总黄酮、大豆苷元、染料木素等抗氧化功能性成分显著提升；总酚含量、总黄酮含量与抗氧化指标之间具有较好的相关性。