桑枝叶富含蛋白质和生物活性物质[1]。但新鲜桑枝叶木质化纤维含量高，饲用价值不高。采用乳酸菌发酵技术能够提高桑枝叶的营养价值，确定有效乳酸菌数量为106 CFU/g（鲜重）[2]。乳酸菌和纤维素酶共同发酵饲料可以提高饲料营养价值[3]。王田田等[4]发现，菌酶协同发酵可显著提高辣木茎叶粉的营养品质和抗氧化活性。岳丽等[5]以益生菌联合纤维素酶和木聚糖酶协同发酵甜高粱秸秆，发现发酵效果明显优于单独用菌或酶。有研究发现，发酵技术可明显提高桑枝叶的饲喂价值，发酵桑枝叶的适宜添加量为仔猪4%[6]、黄牛30%[7-8]、奶山羊16%[9]、育肥猪10%~12%[10-11]、育肥湖羊17.5%~25.0%[12]。近年来，微生物发酵和生物酶解技术广泛应用于新型饲料加工。乳酸菌能够改善饲料品质[13]，纤维素酶可将饲料中的纤维降解为可溶性碳水化合物，为乳酸菌发酵提供底物[3]。目前，乳酸菌与纤维素酶应用于桑枝叶发酵的研究较少。本试验探索乳酸菌与纤维素酶对桑枝叶发酵品质的影响，以期为桑叶发酵饲料的应用研究与开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料桑枝叶采自广西上林县龙昌农业种养专业合作社种植区，去除主茎和发黄叶片，保留约80 cm嫩枝。乳酸菌和纤维素酶均购自山东蔚蓝生物科技有限公司。乳酸菌主要成分为植物乳杆菌，活菌数≥1×1011 CFU/g。纤维素酶活力≥10 000 U/g。发酵饲料袋规格为30 cm×40 cm，22丝。1.2试验设计（见表1）试验采用单因素随机设计。桑枝叶冲洗，去除表面污物，置于阴凉处晾晒过夜，含水量控制在50%~60%，切碎至2.0~3.0 cm，随机分为6等份。按照试验设计，将乳酸菌干粉和纤维素酶用超纯水溶解活化后，均匀喷洒至发酵原料上，对照组使用等量超纯水喷洒，混匀。每袋500 g原料装入带放气阀的专用薄膜发酵饲料袋中，抽真空，密封袋口。25~35 ℃下避光发酵15 d后开袋，分析发酵饲料各项指标，每个重复均取样分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.022.T001表1试验设计组别添加物质添加量对照组——试验L组乳酸菌0.5%试验C组纤维素酶500 mg/kg试验LC组乳酸菌+纤维素酶0.5%+500 mg/kg注：“—”表示无添加。1.3测定指标及方法称取20 g发酵饲料，加入80 mL超纯水，4 ℃浸提24 h，使用双层纱布和滤纸过滤，滤液用于测定pH值及氨态氮、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量。收集剩余发酵桑枝叶样品65 ℃烘干、称重，测定干物质、粗蛋白、粗脂肪、粗灰分、中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量。1.3.1感官评定感官评定按照《青贮饲料质量评定标准》进行，具体指标包括色泽（15分）、气味（15分）、质地（10分）。31~40分为优等；21~30分为良好；11~20分为一般；0~10分为劣等。1.3.2营养指标将预处理的试验样品按照文献[2]方法进行检测。1.3.3发酵品质pH值使用便携式pH计测定；采用苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮含量[14]；LC-20AT高效液相色谱仪（岛津公司）测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸的含量。1.3.4瘤胃降解指标选取3头安装瘤胃瘘管的健康肉牛，测定试验样品48 h的干物质、中性洗涤纤维降解率，具体方法参照高月娥等[15]的研究。1.4数据统计与分析试验数据采用Excel 2010软件进行整理，SPSS 9.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1添加乳酸菌与纤维素酶对桑枝叶发酵效果的感官评定（见表2）由表2可知，发酵15 d后，试验L组、试验C组、试验LC组发酵桑枝叶感官指标均高于对照组。试验L组发酵桑枝叶品质为优等，改善效果明显。试验C组、试验LC组发酵桑枝叶评分均为良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.022.T002表2添加乳酸菌与纤维素酶对桑枝叶发酵效果的感官评定组别气味色泽质地得分等级对照组89421良好试验L组1212731优等试验C组1111527良好试验LC组1112629良好2.2添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶发酵品质的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，各试验组发酵桑枝叶pH值均显著降低（P0.05）；其中试验L组发酵桑枝叶pH值降幅达36.04%，试验C组、试验LC组降幅均为34.56%。结果表明，纤维素酶降低发酵桑枝叶pH值的潜力接近乳酸菌，乳酸菌和纤维素酶均能够提高桑枝叶的发酵品质，与感官评定结果一致。各试验组发酵桑枝叶乳酸和乙酸含量显著高于对照组（P0.05），氨态氮含量显著低于对照组（P0.05）。各组均未检出丁酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.022.T003表3添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶发酵品质的影响组别pH值氨态氮/总氮/%乳酸/%乙酸/%丙酸%丁酸/%对照组6.77±0.23a12.85±0.33a1.05±0.07b0.54±0.09b0.04±0.010试验L组4.33±0.06b10.87±0.66b1.28±0.03a0.74±0.10a0.05±0.010试验C组4.43±0.15b10.43±0.65b1.24±0.07a0.76±0.07a0.04±0.010试验LC组4.43±0.06b10.47±0.68b1.28±0.06a0.74±0.08a0.04±0.020注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶营养成分的影响（见表4）由表4可知，试验L组、试验C组、试验LC组发酵桑枝叶干物质含量分别比对照组高7.47%、7.40%、9.84%，表明添加纤维素酶或乳酸菌发酵桑枝叶，对干物质损失影响不大。试验L组、试验C组、试验LC组发酵桑枝叶粗蛋白含量分别比对照组提高14.00%、8.05%、15.29%（P0.05），表明乳酸菌升高发酵桑枝叶粗蛋白的能力强于纤维素酶，乳酸菌与纤维素酶存在协同作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.022.T004表4添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶营养成分的影响组别干物质粗蛋白粗脂肪粗灰分中性洗涤纤维酸性洗涤纤维对照组54.87±1.3212.43±0.85b1.73±0.67b8.70±0.2039.30±0.6222.40±0.26a试验L组58.97±4.7614.17±0.31a2.06±0.46b9.83±1.1638.70±4.9421.73±0.47a试验C组58.93±5.6613.43±0.35a1.87±0.55b9.87±0.7836.23±2.3019.63±0.60b试验LC组60.27±6.8314.33±0.25a3.47±0.59a9.47±0.4238.90±0.4618.77±0.40c%与对照组相比，试验LC组发酵桑枝叶粗脂肪含量显著提高（P0.05）；试验C组和试验LC组发酵桑枝叶酸性洗涤纤维含量显著降低（P0.05），其中以试验LC组酸性洗涤纤维含量最低。试验L组发酵桑枝叶酸性洗涤纤维含量显著高于试验LC组、试验C组（P0.05）。结果表明，乳酸菌与纤维素酶能够协同降解桑枝叶的纤维营养成分。2.4添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶瘤胃降解指标的影响（见表5）由表5可知，试验L组、试验C组、试验LC组发酵桑枝叶干物质降解率显著高于对照组（P0.05）。研究表明，纤维素酶或乳酸菌发酵桑枝叶可改善饲喂效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.022.T005表5添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶瘤胃降解指标的影响组别干物质降解率中性洗涤纤维降解率对照组48.81±0.99b45.06±0.43b试验L组51.35±0.29a47.16±0.22a试验C组51.92±0.30a46.84±0.74a试验LC组52.15±0.24a47.37±0.46a%3讨论3.1发酵桑枝叶的感官评定分析侯美玲等[14]利用纤维素酶或乳酸菌发酵天然牧草60 d后发现，发酵天然牧草感官得分高于对照组。黄小云等[16]设计纤维素酶、乳酸菌或乳酸菌和纤维素酶联用发酵狼尾草和圆叶决明45 d后发现，乳酸菌处理组、乳酸菌和纤维素酶联用处理组感官评分最高。本试验中，经15 d发酵后，各试验组发酵桑枝叶感官评定等级均为良好，具有乳酸芳香味、无丁酸臭味、茎叶结构保持较好、无霉变腐败。乳酸菌处理组发酵桑枝叶品质为优等，开袋能够闻到浓郁的乳酸芳香味，茎叶结构完整，颜色接近桑叶原色，发酵效果明显。本试验表明，添加乳酸菌、纤维素酶或两者联用均可显著降低发酵桑枝叶的pH值，从而提高发酵桑枝叶感官评定等级。3.2添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶发酵品质的影响有研究表明，应用乳酸菌和纤维素酶可使茭白叶青贮饲料pH值迅速下降[17]。本试验中，单独或联合添加乳酸菌与纤维素酶均可显著降低发酵桑枝叶pH值；纤维素酶降低发酵桑枝叶pH值的潜力接近乳酸菌，与宋铁镇等[18]、万江春等[19]、魏晓斌等[20]、谢凤莲等[21]、黄丽萍等[22]、白长胜[23]研究结果一致。发酵中产生的乳酸含量越高，丁酸含量越低，表明发酵效果越好[24]。本试验中，与对照组相比，添加乳酸菌、纤维素酶或两者联用均显著提高发酵桑枝叶乳酸和乙酸的含量，所有样品中均未检出丁酸。氨态氮含量可以反映发酵中蛋白质的降解程度，该值越低，发酵质量越好。本试验中，与对照组相比，试验组氨态氮含量显著降低。结果表明，单独或联合添加乳酸菌与纤维素酶均能够显著改善桑枝叶发酵品质，与Addah等[25]、黄媛等[26]研究结果一致。3.3添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶营养成分的影响孙永[27]应用植物乳杆菌和纤维素酶对高粱进行发酵，发现高粱干物质含量提高8.33%。本试验中，与对照组相比，单独或联合添加乳酸菌与纤维素酶发酵桑枝叶干物质含量分别升高7.47%、7.40%、9.84%，与黄丽萍等[22]、黄媛等[26]研究结果一致。有研究表明，添加纤维素酶能够减少桑枝叶干物质的损失[28]。乳酸菌发酵产生大量乳酸，降低桑枝叶pH值，进而抑制植物蛋白酶和微生物对桑枝叶蛋白质的降解，减少干物质损失，提高粗蛋白含量[29]。微生物发酵中能够产生次级代谢产物和菌体蛋白，可提高发酵饲料的粗蛋白和干物质含量[26]。本试验中，与对照组相比，单独添加乳酸菌、纤维素酶，发酵桑枝叶粗蛋白含量升高14.00%、8.05%，中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量下降；联合添加乳酸菌与纤维素酶显著升高发酵桑枝叶粗蛋白含量，降低酸性洗涤纤维含量，与谢凤莲等[21]、孙贵宾等[30]研究结果一致。有研究表明，乳酸菌和纤维素酶可有效提高桑枝叶营养品质，降低中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量，提高粗蛋白含量[31]。本试验中，单独或联合添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶粗脂肪和粗灰分含量均无显著影响，与何伟等[32]研究结果一致。各试验组桑枝叶的粗脂肪和粗灰分含量较发酵前均有所增加，主要原因是发酵过程中可溶性碳水化合物等有机质损失，使这些成分的比例增加[26]。3.4添加乳酸菌与纤维素酶对发酵桑枝叶瘤胃降解指标的影响干物质和中性洗涤纤维的降解率可衡量反刍动物采食量，降解率越高，干物质采食量越好。王挺等[33]利用乳酸菌发酵番茄皮渣与苜蓿混合物，检测瘤胃降解24 h，发现乳酸菌显著提升干物质和中性洗涤纤维的降解率。郝建辉[34]研究发现，干物质和中性洗涤纤维的瘤胃降解率均高于对照组。本试验中，与对照组相比，单独或联合添加乳酸菌与纤维素酶均显著提高干物质和中性洗涤纤维的瘤胃降解率。乳酸菌通过破坏植物细胞壁，提高瘤胃降解率[33]；纤维素酶依靠分解纤维素，提高瘤胃降解率[34]。本试验结果表明，纤维素酶或乳酸菌发酵桑枝叶可改善桑枝叶发酵饲料的消化性，提升饲喂效果。4结论本试验结果表明，单独或联合添加乳酸菌与纤维素酶均能够显著改善桑枝叶发酵品质，提高桑枝叶的营养价值及饲喂效果，且以乳酸菌和纤维素酶联合使用时效果较好。