藿香蓟为菊科藿香蓟属一年生草本植物[1-2]，主要分布于我国南方各省，能够治疗腹泻、发烧、咽喉肿痛、外伤出血[2-4]。藿香蓟含有挥发油、多酚、黄酮、萜类及生物碱等活性成分[4-5]，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌及保肝等作用[6]。畜禽养殖过程中使用抗生素会产生药物残留以及耐药菌株[7]。植物多酚类化合物含有大量酚羟基，可有效清除活性氧[8]，具有抗氧化、抗应激及抗炎等作用[9]。研究表明，在猪、鸡、牛等畜禽日粮中添加植物多酚（桉叶多酚、茶多酚等）能够提高畜禽生长性能、抗氧化功能及免疫功能，调节肠道功能，改善肉品质[10-12]。植物多酚是藿香蓟的主要活性成分，但藿香蓟多酚在动物生产中的应用报道较少。目前，植物多酚提取方法较多[9]，其中超声辅助提取法具有节能、省时、高效以及对提取物影响小等特点[13-14]。基于此，本研究采用超声辅助提取藿香蓟多酚，通过响应面分析法优化提取工艺，探究藿香蓟多酚抗氧化活性，旨为藿香蓟在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与试剂藿香蓟全草采自广西南宁市乡村世界，经广西中医药大学梁子宁教授鉴定为藿香蓟。没食子酸标准品（批号0831-9501）购自中国药品生物制品检定所；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，S90790-379）、2, 2'-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）均购自Sigma公司，维生素Ｃ（批号F20081016）购自国药集团化学试剂有限公司），三氯乙酸、三氯化铁、铁氰化钾、硝酸铝、亚硝酸钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。1.2试验仪器UV-1780紫外-可见光分光光度计（日本岛津公司），BP211D电子分析天平（赛多利斯公司），JP-040超声波清洗机（深圳市结盟清洗设备有限公司），RE-201D旋转蒸发器（巩义市英峪予华仪器厂），LD24-2自动平衡离心机（金坛市医疗仪器厂），SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵（巩义市英峪予华仪器厂）。1.3测定指标及方法1.3.1藿香蓟多酚提取液的制备将低温干燥后的藿香蓟全草粉碎过80目筛。精密称取藿香蓟干粉末2.00 g，按照不同液料比加入乙醇溶液，置于150 mL锥形瓶中，不同提取温度下进行超声。提取液抽滤去除药渣，离心，取上清液定容，得供试品溶液，测定多酚含量。1.3.2藿香蓟多酚得率以没食子酸为标准品，采用Folin-Ciocalteu比色法，参照文献[15]的方法测定藿香蓟多酚含量。在765 nm处测定吸光度，没食子酸标准曲线回归方程为y=0.0 118x+0.000 3，R2=0.997 2（其中：x为吸光度，y为没食子酸质量浓度）。按照没食子酸标准曲线回归方程计算藿香蓟样品中多酚含量。藿香蓟多酚得率=(多酚总质量/药材干重)×100%(1)1.3.3单因素试验设计精密称取藿香蓟干粉末2.00 g若干份置于锥形瓶中，进行单因素试验。设定液料比为20 mL/g、提取温度为30 ℃、超声时间为30 min，检测乙醇浓度分别为30%、40%、50%、60%、70%时的藿香蓟多酚得率。设定液料比为20 mL/g、提取温度为30 ℃、乙醇浓度为40%，检测超声时间分别为10、20、30、40、50 min时的藿香蓟多酚得率。设定乙醇浓度为40%、超声时间为30 min、提取温度为30 ℃，检测液料比分别为10、20、30、40、50 mL/g时的藿香蓟多酚得率。设定液料比为20、乙醇浓度为40%、超声时间为30 min，检测提取温度分别为30、40、50、60、70 ℃时的藿香蓟多酚得率。设定液料比20、乙醇浓度为40%、超声时间为30 min、提取温度为30 ℃，检测提取次数分别为1、2、3次时的藿香蓟多酚得率。1.3.4Box-Behnken响应面试验设计在单因素试验基础上，以藿香蓟多酚得率为响应值，根据Box-Behnken设计原理[16-17]，采用Design Expert 13软件设计响应面试验，响应面试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.T001表1响应面试验因素水平设计水平A乙醇浓度/%B超声时间/minC液料比/(mL/g)D提取温度/℃-1302020300403030401504040501.3.5藿香蓟多酚清除ABTS、DPPH自由基的能力将藿香蓟多酚提取液分别配制为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 g/L的待测液。参照Feng等[18]方法测定藿香蓟多酚对ABTS自由基的清除能力。参照Li等[19]方法测定藿香蓟多酚对DPPH自由基的清除能力。同浓度VC标准液为阳性对照。自由基清除率=(1-A1/A0)×100%(2)式中：A1为加样品溶液后ABTS或DPPH自由基溶液的吸光度；A0为未加样品溶液前ABTS或DPPH自由基溶液的吸光度。1.3.6藿香蓟多酚还原能力将藿香蓟多酚提取液配制成不同质量浓度的待测液，参照Liu等[20]方法测定藿香蓟多酚还原能力。以蒸馏水为对照，在700 nm处测定溶液吸光值。同浓度VC标准液为阳性对照。1.4数据统计与分析采用Origin 2018软件对试验数据进行统计与分析，Design Expert 13软件进行响应面设计与分析。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇浓度对藿香蓟多酚得率的影响（见图1）由图1可知，藿香蓟多酚得率随乙醇浓度的增大呈现先升高后下降趋势。当乙醇浓度为40%时，藿香蓟多酚得率最高。原因可能是一定浓度的乙醇溶液能够削弱多酚与蛋白质、多糖之间的疏水作用，藿香蓟多酚提取率升高[21]；乙醇浓度过高时，造成多酚与提取溶剂间极性相差过大，藿香蓟多酚提取率下降[22]。因此，选择40%的乙醇进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F001图1乙醇浓度对藿香蓟多酚得率的影响2.1.2超声时间对藿香蓟多酚得率的影响（见图2）由图2可知，藿香蓟多酚得率随超声时间的延长呈现先升高后下降趋势。当超声时间为30 min时，藿香蓟多酚得率最高。原因可能是提取初期超声的机械作用、空化作用及热效应使溶剂快速溶出，藿香蓟多酚提取率升高；30 min后，长时间的超声作用使部分多酚降解，藿香蓟多酚提取率下降[22]。因此，选择30 min超声时间进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F002图2提取时间对藿香蓟多酚得率的影响2.1.3液料比对藿香蓟多酚提取率的影响（见图3）由图3可知，藿香蓟多酚得率随液料比的增加呈现先升高后下降的趋势。当液料比为30 mL/g时，藿香蓟多酚得率最高。原因可能是随着溶剂量的提高，溶剂扩散速度加快，有利于藿香蓟多酚溶出[23]；溶剂量过大，物料被溶剂包裹，促进其他杂质的溶出，降低了藿香蓟多酚得率。因此，选取30的液料比进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F003图3料液比对藿香蓟多酚得率的影响2.1.4提取温度对藿香蓟多酚得率的影响（见图4）由图4可知，藿香蓟多酚得率随着提取温度的升高呈现先增大后减小的趋势。当温度为40 ℃时，藿香蓟多酚得率最大。原因可能是升高温度可以加快了多酚的扩散速度，促进藿香蓟多酚溶出[21]。提取温度过高，造成多酚类物质的氧化和分解，降低藿香蓟多酚得率[24]。因此，选取40 ℃提取温度进行下一步试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F004图4提取温度对藿香蓟多酚得率的影响2.1.5提取次数对藿香蓟多酚得率的影响（见图5）由图5可知，藿香蓟多酚得率随着提取次数的增加呈现先增大后减小的趋势。当提取次数为2次时，藿香蓟多酚得率最大。原因可能是长时间的超声波作用增大植物细胞破裂程度，部分多酚被降解[21]。提取2次的藿香蓟多酚得率与1次比，增幅较小。因此，选取提取1次用于后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F005图5提取次数对藿香蓟多酚得率的影响2.2响应面优化试验结果2.2.1响应面试验结果（见表2、表3）在单因素试验结果中，乙醇浓度、超声时间、料液比、提取温度对藿香蓟多酚得率影响较大。运用Design Expert 13软件进行多元回归拟合分析，得到超声辅助提取藿香蓟多酚得率的预测值（Y）对乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、料液比（C）、提取温度（D）的二次多元回归方程为Y=4.66-0.009 2A+0.052 0B+0.278 3C+0.645 8D+0.282 5AB+0.272 5AC-0.922 5AD+0.240 0BC-0.077 5BD+0.682 5CD-0.620 5A2-0.464 2B2-0.274 3C2-0.835 5D2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.T002表2响应面试验结果编号A/%B/minC/(mL/g)D/℃多酚得率/%1303040403.932503030502.283402040403.984402030301.955403030404.596303030302.317403040505.318404030504.439402020404.0110403030405.0511303030504.1712403030404.3113304030403.3414402030504.4115503020402.8716302030403.6517403020503.4818403030405.0819404030302.2820404040404.3421504030404.222404020403.4123503040404.1724502030403.3825403040302.3926403030404.2527303020403.7228503030304.1129403020303.29由表3可知，F=4.89，P=0.002 7，表明该模型极显著（P0.01）。失拟项不显著（P0.05），表明该模型误差小。R2=0.932 6，调整相关系数R2Adj=0.915 3，表明该模型拟合度良好，试验组误差小[17]。因此，模型方程可用于藿香蓟多酚超声辅助提取结果的分析和预测。在方差分析中，一次项D、二次项A2、D2对藿香蓟多酚得率有极显著影响（P0.01）；一次项C、二次项B2对多酚得率有显著影响（P0.05）。在交互项中，AD对多酚得率有极显著影响（P0.01），CD对多酚得率有显著影响（P0.05）。由F值可知，各因素对藿香蓟多酚得率的影响顺序为DCBA。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型18.450 0141.320 04.890 00.002 7A0.001 010.001 00.003 70.952 1B0.032 010.032 00.118 80.735 4C1.670 011.670 05.380 00.035 9D5.010 015.010 018.570 00.000 7AB0.319 210.319 21.180 00.294 9AC0.297 010.297 01.100 00.311 7AD3.400 013.400 012.630 00.003 2BC0.230 410.230 40.854 60.370 9BD0.024 010.024 00.089 10.769 7CD1.860 011.860 06.910 00.019 8A22.500 012.500 09.260 00.008 8B21.400 011.400 05.190 00039 0C20.487 910.487 92.850 00.113 7D24.530 014.530 016.800 00.001 1残差3.770 0140.269 6失拟项3.150 0100.315 02.020 00.260 0纯误差0.623 940.156 0总离差22.220 028注：P0.01表示影响极显著，P0.05表示影响显著。2.2.2各因素交互作用对藿香蓟多酚得率的影响（见图6）图6各因素交互作用对藿香蓟多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F6a1（a）乙醇浓度和超声时间对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F6a2（b）乙醇浓度和液料比对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F6a3（c）乙醇浓度和提取温度对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F6a4（d）超声时间和液料比对多酚得率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F6a5（e）超声时间和提取温度对多酚得率的影响由图6（b）、6（c）、6（f）可知，响应面的坡度较陡，等高线图的圆心趋于椭圆，表明乙醇浓度与料液比、乙醇浓度与提取温度、料液比与提取温度的交互作用对藿香蓟多酚得率有显著影响。由图6（a）、6（d）、6（e）可知，响应面的坡度较平缓，高线图的圆心接近圆形，表明乙醇浓度和超声时间、超声时间和料液比、超声时间与提取温度的交互作用对藿香蓟多酚得率影响较小。从等高线的疏密度可以判断出，提取温度对藿香蓟多酚得率的影响最大，料液比次之，乙醇浓度最小，与表3方差分析结果一致。随着料液比、提取温度升高，藿香蓟多酚得率逐渐增大；随乙醇浓度、超声时间增加，藿香蓟多酚得率先增加后减小。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F6a6（f）液料比和提取温度对多酚得率的影响2.2.3最佳工艺条件的确定和模型的验证在试验范围内，利用已建立的数学模型优化藿香蓟多酚提取工艺，得出最佳提取工艺为乙醇浓度34.85%、提取时间30.75 min、液料比40 mL/g、提取温度50 ℃，藿香蓟多酚得率预测值5.33%。结合实际情况将藿香蓟多酚提取条件进行修正，得出最佳提取工艺为乙醇浓度35%、提取时间30 min、液料比为40 mL/g、提取温度50 ℃。在此条件下进行藿香蓟多酚的提取，连续试验3次，藿香蓟多酚平均得率为5.32%，与预测值接近，表明该模型与实际情况拟合良好。2.3藿香蓟多酚体外抗氧化能力2.3.1藿香蓟多酚对DPPH自由基清除能力（见图7）由图7可知，藿香蓟多酚、VC对DPPH自由基清除率均随着藿香蓟多酚质量浓度的增大而升高。相同质量浓度下，藿香蓟多酚对DPPH自由基清除能力明显低于VC。当藿香蓟多酚为4.5 g/L时，藿香蓟多酚对DPPH自由基清除率为93.4%，清除效果接近于浓度为0.8~1.0 g/L的VC清除效果，表明藿香蓟多酚对DPPH自由基有较好的清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F007图7藿香蓟多酚对DPPH自由基的清除能力2.3.2藿香蓟多酚对ABTS自由基清除能力（见图8）由图8可知，VC在0.2~1.5 g/L的浓度范围内，对ABTS自由基的清除率无明显差异（91.75%~99.14%）。藿香蓟多酚对ABTS+自由基清除率随浓度的增加显著提高。相同质量浓度下，藿香蓟多酚对ABTS自由基清除率低于VC。当藿香蓟多酚为4.5 g/L时，藿香蓟多酚对ABTS自由基清除率为96.2%，清除效果接近于浓度为0.4 g/L的VC清除效果，表明藿香蓟多酚具有较强的ABTS自由基清除能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F008图8藿香蓟多酚对ABTS自由基的清除能力2.3.3藿香蓟多酚的还原能力（见图9）由图9可知，在0.2~1.5 g/L的浓度范围内，相同浓度藿香蓟多酚还原能力比VC低，但藿香蓟多酚的原能力与质量浓度之间呈显著的量效关系。当藿香蓟多酚为4.5 g/L时，藿香蓟多酚还原能力接近于浓度为0.8 g/L的VC，表明藿香蓟多酚具有较强的还原能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.016.F009图9藿香蓟多酚的还原能力3结论采用超声辅助提取藿香蓟多酚，通过响应面法优化得到最佳提取工艺为乙醇浓度35%、提取时间30 min、液料比40 mL/g、提取温度50℃，在此条件下藿香蓟多酚得率为5.32%，与模型预测值5.33%接近，表明该模型可作为藿香蓟多酚的有效提取方法。藿香蓟多酚体外抗氧化能力试验结果显示，当藿香蓟多酚浓度为4.5 g/L时，对ABTS、DPPH自由基清除率分别为93.4%、96.2%，还原能力接近于浓度为0.8 g/L的VC，表明藿香蓟多酚具有较强的抗氧化能力