金黄色葡萄球菌可引起化脓性感染等症状，是畜禽中毒的重要病原体。目前，寻找低毒、低残留的抗生素天然替代物成为饲料领域的研究热点。黄芩是我国传统的中草药，为唇形科植物黄芩的干燥根。黄芩的来源广、成本低、生物活性稳定，具有免疫调节[1-2]、抗炎[3-5]、抗肿瘤[6-7]、抗氧化[7-8]、抗病毒[9]等作用，具有明显的抗菌活性[10-11]。黄芩提取物可以显著提高金黄色葡萄球菌感染的小鼠存活率[12-13]。目前，已发现黄芩对金黄色葡萄球菌的抗菌作用，但其抗菌机制方面的研究较少。细胞膜是细菌的保护屏障之一，当菌体细胞膜受到损伤后，细菌内环境受到损害，细胞膜的通透性发生改变，使DNA和RNA等大分子物质渗到菌体外。板蓝根、佛手等可增加金黄色葡萄球菌的细胞膜通透性，发挥抗菌作用[14]。黄芩提取物可抑制细菌生物膜生成[15-17]，但其抗金黄色葡萄球菌的作用机制尚未明确。因此，本文探究了黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌活性及作用机制，为进一步明确黄芩提取物对金黄葡萄球菌的作用，为开发绿色、有效的天然饲料添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料黄芩饮片（1 000 g/袋，临沂康宇中药饮片有限公司），金黄色葡萄球菌（菌株编号：CICC10001，上海兽徽科技有限公司）。营养肉汤培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）、营养琼脂培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）。1.2试验试剂考马斯亮蓝G-250（上海碧云天生物技术有限公司），氯化钠（纯度≥99.5%，德国Sigma有限公司），无水乙醇（纯度≥99.8%，上海阿拉丁试剂有限公司）。1.3试验仪器SW-CJ-2FD双人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司）、TDZ4-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、UV-1100可见分光光度计（上海美谱达有限公司）、3K15高速台式冷冻离心机（德国Sigma公司）、ZD-85气浴恒温振荡器（江苏金坛市医疗仪器厂）。1.4测定指标及方法1.4.1黄芩提取物制备称量黄芩饮片5 000 g，加入60 L纯化水，浸泡提取2 h（每隔30 min，外循环混合料液5 min），趁热过滤，将提取液收集于储存罐Ⅰ中，再转至储存罐Ⅱ中，提取过程重复3次。在第2、3次提取时，各加入50 L纯化水，提取1 h。将提取液置于浓缩机中（温度低于85 ℃、真空度高于60 Pa），浓缩至相对密度为1.03~1.05（80 ℃）。向冷却至40 ℃的浓缩液中加入95%乙醇，至乙醇浓度为75%，搅拌30 min，密封，静置12 h。使用真空泵将乙醇混合液抽滤回收，80 ℃真空干燥5 h。1.4.2黄芩提取物含量制作标准曲线：称取100 mg葡萄糖，置于500 mL容量瓶中，配制浓度为0.2 g/L的葡萄糖标准溶液。分别向10支试管中加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖标准溶液，用蒸馏水定容至2 mL。加入2 mL浓度为5%的苯酚溶液，再加入5 mL硫酸溶液，混匀，室温静置30 min，沸水浴15 min，冷却至室温，在OD490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，各管葡萄糖溶液浓度为横坐标，标准曲线为y=0.004 8x-0.012 9。苯酚-硫酸法制作葡萄糖标准曲线见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.F001图1苯酚-硫酸法制作葡萄糖标准曲线样品含量测定：将黄芩提取物配制浓度为0.2 g/L的溶液，吸取0、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL样液，测定OD490 nm处吸光度，计算样品中多糖含量，评价黄芩活性成分提取效率[18-19]。测定黄芩多糖含量约为31%。1.4.3抑菌圈测定采用牛津杯试验法，将牛津杯置于涂有100 μL的试菌液平板上。使用生理盐水溶解黄芩提取物，配制浓度为20 g/L的溶液。吸取150 μL溶液悬空滴加于牛津杯中，37 ℃培养24 h。采用游标卡尺测量抑菌圈直径。细菌对药物的敏感程度判定标准见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.T001表1细菌对药物的敏感程度判定标准抑菌圈直径/mm2015~2010~14100敏感度极敏高敏中敏低敏不敏1.4.4最低抑菌浓度（MIC）采用二倍稀释法[12]，在96孔板中，2~8孔预先加入100 μL培养液。第1号孔加入200 μL黄芩提取物，从中吸取100 μL样品液至第2号孔，依次类推进行倍比稀释，至第8号孔。1~8号孔依次加入10 μL 1×105 CFU/mL菌液。第9号孔中加入等量培养液、菌液及生理盐水，为对照组。第10号孔只加培养液，为空白对照。加样完成，37 ℃培养24 h。根据肉眼查看溶液是否浑浊，各孔中OD600 nm值，判定MIC。每组设3个重复。1.4.5最低杀菌浓度（MBC）根据MIC试验结果，将肉眼查看澄清的各孔溶液进行涂板，37 ℃培养24 h，观察琼脂平板上菌落生长情况。以无菌落生长的最低药物浓度为黄芩提取物的MBC。1.4.6时间-杀菌效果培养液皿中加入一定浓度黄芩提取物溶液和一定量的培养液，配制成1/4 MIC、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC、4 MIC的样品，各加入1×105 CFU/mL金黄色葡萄球菌悬液。对照组加入等量培养液、生理盐水、1×105 CFU/mL金黄色葡萄球菌悬液。37℃培养30 h，每隔1 h取样，测定OD600 nm处吸光度。每组设3个重复。1.4.7胞外核酸培养液中加入黄芩提取物，将药物浓度调整为1 MIC、2 MIC，加入菌悬液，稀释成1×104 CFU/mL。对照组在培养液和菌液混合液中加入等量生理盐水。37 ℃培养12 h，以4 000 r/min离心10 min，测定OD600 nm处吸光度。每组设3个重复。1.4.8胞外可溶性蛋白菌液培养、药物处理方法参考1.4.5。培养12 h，以4 000 r/min离心10 min，取上清液加入考马斯亮蓝，静置10 min测定OD595 nm处吸光度。每组设3个重复。1.5数据统计与分析采用Excel软件、SPSS 19.0软件对试验数据进行统计分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性2.1.1金黄色葡萄球菌对黄芩提取物的敏感性（见图2）由图2可知，牛津杯试验法测定的黄芩提取物对金黄葡萄球菌的抑菌圈约为31 mm，表明金黄葡萄球菌对黄芩提取物极敏感（≥20 mm）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.F002图2金黄色葡萄球菌对黄芩提取物的敏感性研究表明，黄芩提取物对金黄色葡萄球菌具有较强的体外抗菌活性。2.1.2黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌效果（图3、图4、表2、表3）由图3可知，第1~2排为黄芩提取物处理组，1~10孔按以下情况加药：1为20 g/L黄芩提取物、2为10 g/L黄芩提取物、3为5 g/L黄芩提取物、4为2.5 g/L黄芩提取物、5为1.25 g/L黄芩提取物、6为0.625 g/L黄芩提取物、7为0.312 5 g/L黄芩提取物、8为0.156 25 g/L黄芩提取物、9为生理盐水对照组、10为培养液对照组，3~4排为生理盐水对照组，5~6排为培养液对照组1.25 g/L浓度以上的黄芩提取物。黄芩提取物对金黄葡萄球菌的抑制作用显著（P0.05）。图3不同浓度黄芩提取物对金黄色葡萄球菌抗菌效果注：不同字母表示差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.F3a1（a）黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的抑制效果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.F3a2（b）金黄色葡萄球菌液吸光度由图4可知，当黄芩提取物浓度为2.50 g/L时，培养板中无金黄葡萄球菌生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.F004图4最低杀菌浓度的黄芩提取物对金黄色葡萄球菌抗菌效果由表2、表3可知，黄芩提取物对金黄葡萄球菌的MIC为1.25 g/L，MBC为2.50 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.T002表2黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的MIC项目黄芩提取物质量浓度/(g/L)生理盐水MIC/(g/L)20.00010.0005.0002.5001.2500.6250.3130.156金黄色葡萄球菌液生长情况-----++++1.250注：“-”表示抑菌，“+”表示细菌生长；下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.T003表3黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的MBC项目黄芩提取物质量浓度/(g/L)生理盐水MBC/(g/L)20.00010.0005.0002.5001.250金黄色葡萄球菌液生长情况----++2.5002.1.3不同剂量黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌效果（见表4）由表4可知，在30 h时，2 MIC组、4 MIC组的金黄色葡萄球菌数量显著低于对照组（P0.05），表明2 MIC组、4 MIC组可连续30 h抑制金黄葡萄球菌生长。在15 h时，1 MIC组的金黄色葡萄球菌数量显著低于对照组（P0.05），表明1 MIC组可连续15 h抑制金黄葡萄球菌生长。1/4 MIC组的金黄色葡萄球菌在第6 h开始增多；1/2 MIC组的金黄色葡萄球菌在第9 h开始增多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.T004表4不同剂量黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌效果组别1 h2 h3 h4 h5 h6 h7 h8 h9 h10 h15 h30 h1/4 MIC组0.056±0.0010.055±0.0020.055±0.0020.061±0.0070.056±0.0010.062±0.001B0.082±0.002B0.108±0.004A0.116±0.004B0.104±0.011B0.166±0.040B0.224±0.041AB1/2 MIC组0.058±0.0040.057±0.0010.056±0.0030.055±0.0020.054±0.0010.051±0.002C0.058±0.005C0.067±0.014B0.088±0.011C0.111±0.008B0.116±0.005B0.233±0.012AB1 MIC组0.057±0.0020.061±0.0020.062±0.0010.069±0.0080.054±0.0000.052±0.000C0.053±0.001D0.053±0.001B0.056±0.002D0.052±0.002C0.076±0.021C0.191±0.044B2 MIC组0.056±0.0010.063±0.0040.057±0.0010.060±0.0010.063±0.0030.055±0.001C0.054±0.001D0.059±0.005B0.056±0.001D0.055±0.001C0.058±0.001C0.057±0.001C4 MIC组0.058±0.0010.068±0.0100.061±0.0020.062±0.0020.065±0.0060.059±0.000C0.060±0.002D0.061±0.001B0.060±0.000D0.060±0.000C0.067±0.004C0.060±0.002C生理盐水0.055±0.0020.054±0.0010.058±0.0040.057±0.0010.057±0.0010.072±0.003 A0.113±0.001A0.129±0.010A0.146 ± 0.009 A0.198±0.008A0.247±0.002A0.272±0.028A注：同列数据肩标不同大写字母表示差异显著（P0.05），相同大写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.2黄芩提取物对金黄色葡萄球菌抗菌活性的作用机制2.2.1黄芩提取物对金黄色葡萄球菌胞外核酸的影响（见图5）由图5可知，1 MIC组、2 MIC组的金黄色葡萄球菌胞外核酸浓度均显著高于对照组（P0.05）。研究表明，黄芩提取物可破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜结构，使菌体胞内核酸渗出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.F005图5黄芩提取物对金黄色葡萄球菌胞外核酸的影响注：同一时间折线上方不同字母表示差异显著（P0.05）；下图同。2.2.2黄芩提取物对金黄色葡萄球菌胞外可溶性蛋白的影响（见图6）由图6可知，用药后1、5、9 h，2 MIC组的金黄色葡萄球菌胞外可溶性蛋白均显著高于对照组（P0.05）。用药后1 h，1 MIC组的金黄色葡萄球菌胞外可溶性蛋白显著高于对照组（P0.05）。研究表明，用药后1 h，黄芩提取物可破坏金黄色葡萄球菌的细胞膜结构，使菌体胞内蛋白质渗出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.017.F006图6黄芩提取物对金黄色葡萄球菌胞外可溶性蛋白的影响3讨论3.1黄芩提取物对金黄色葡萄球菌抗菌活性本试验抑菌圈结果表明，黄芩提取物对金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌活性，与前人研究结果一致[20-21]。本研究中，抑菌圈直径较大可能与较高的黄芩提取液浓度有关。本试验中，黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的MIC为1.25 g/L，该剂量低于黄芩水煎剂滤液对金黄色葡萄球菌的MIC（31 g/L）[22]。原因可能是与常规生药煎煮、滤液浓缩方法得到的药液相比，水提醇沉法获得黄芩提取物有效成分更高；除了提取方法外，黄芩生长期不同也影响提取物中的有效成分含量。张有志等[21]研究发现，黄芩生长越久，多糖提取率越高。黄芩多糖对金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌活性，MIC（0.625 g/L）显著低于本试验中剂量[23-25]，表明黄芩多糖单体抗金黄色葡萄球菌较强。黄芩苷和黄芩素对金黄色葡萄球菌具有明显的抗菌活性，MIC分别为1.000 0、0.062 5 g/L[26]。3.2黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌效果时间-杀菌关系描述黄芩提取物对金黄色葡萄球菌随着时间和浓度变化的作用趋势[27]。目前，关于黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的时间-杀菌效果尚未见报道。本试验中，1 MIC组、2 MIC组、4 MIC组对金黄色葡萄球菌的抑制活性分别持续15、30、30 h。因此，黄芩提取物浓度越高，抑制金黄色葡萄球菌的效果越强。3.3黄芩提取物对金黄色葡萄球菌的抗菌机制干扰或抑制细菌核酸和蛋白质的合成是抗菌药物作用机制[28]。Bayer等[29]和Berti等[30]研究表明，抗生素可以通过破坏致病菌的细胞膜发挥抑菌效果。细胞膜是一种超分子结构，是细菌与环境之间物质、能量交换、信息传递的重要通道[31-34]。本试验中，黄芩多糖可使金黄色葡萄球菌胞外蛋白和核酸含量增加，表明黄芩提取物可通过影响金黄色葡萄球菌细胞膜通透性，使菌体内蛋白质、核酸、碱性磷酸酶等大分子物质外漏，导致细菌死亡。4结论本研究表明，黄芩提取物对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抗菌活性，可通过破坏金黄色葡萄球菌细胞膜，使菌体内蛋白质、核酸等物质外漏发挥长效抗菌作用。