反刍动物的瘤胃、网胃和瓣胃不分泌胃液，其消化功能由微生物完成。胃室成熟时，瘤胃占4个胃的85%。日粮中碳水化合物为动物提供75%~85%的能量，其中大部分在瘤胃内消化代谢[1]，因此瘤胃具有代表性且极其复杂的微生物群落。瘤胃微生物的厌氧发酵与宿主生产力密切相关，并且随着反刍动物发育，瘤胃微生物区系也在不同发育阶段有规律地形成相应的动态平衡。动态稳定的瘤胃微生物菌群对宿主健康、饲料消化率、畜产品质量和环境等多方面具有重要作用。据预测，2050年全球人口估计将达近97亿，农业生产需求增加70%[2-3]。因此，农业对动物源性食品的需求可能大幅增加，同时也会面临尽量减少环境影响的压力。研究表明，3周龄之前是反刍动物瘤胃调控的“黄金窗口期”[4]，因此通过调控幼龄反刍动物微生物群落提高生产效率成为畜牧领域热点之一。本文介绍了反刍动物瘤胃中的细菌、产甲烷菌、真菌和原虫，瘤胃微生物区系的主要作用和定植规律，为瘤胃早期调控、探究饲料在瘤胃中的降解规律提供参考，从而提高反刍动物生产性能、获得更高的经济效益。1瘤胃微生物反刍动物瘤胃pH值一般在6~7之间，平均温度为39 ℃，这种特殊环境为瘤胃微生物提供了良好的生长条件。反刍动物瘤胃微生物约占瘤胃液的10%，主要有细菌、产甲烷菌、真菌和原虫四大类，约1010~1011个细菌、106~108个产甲烷菌、103~106个真菌和104~106个原虫生存于1 mL瘤胃液中[4]。它们与反刍动物经过长时期适应，存在相互依赖、竞争的关系。1.1瘤胃细菌细菌在瘤胃微生物中无论是数量还是种类均占优势，有300多个种类，并且已鉴定60种瘤胃细菌。在瘤胃液中生存的细菌占20%~30%，附着在饲料颗粒上的细菌占70%~80%，附着在瘤胃壁上的细菌占1%~2%[5-7]。基于16S rRNA的方法估计细菌数量，拟杆菌门和厚壁菌门是优势菌门，具有最高的丰度和最多的物种级操作分类单元（OTU）[8]。在科水平上，普雷沃氏菌科和毛螺菌科为优势菌群，分别为拟杆菌门和厚壁菌门最主要的科[9]。在属水平上，普雷沃氏菌属是许多反刍动物物种中丰富度最高的优势菌群[10]。1.2瘤胃产甲烷菌产甲烷菌是一种专性厌氧菌，属于古菌域的广古菌门，约占古菌的99.2%。古菌具有细菌的外观特性，却在系统发育上不同。Janssen等[11]报道，正常养殖条件下，古菌的rRNA约占所有瘤胃微生物总核糖体RNA（16S和18S）文库的0.3%~3.3%。产甲烷菌数量比细菌少，但在瘤胃中占主导地位。按甲烷菌的表型特征和系统发育，产甲烷菌已发展为4个纲和7个目，分别为甲烷杆菌纲、甲烷球菌纲、甲烷微菌纲、甲烷火菌纲，甲烷杆菌目、甲烷球菌目、甲烷微菌目、甲烷八叠球菌目、甲烷火菌目、甲烷原体目、甲烷胞菌目。甲烷杆菌属、甲烷微菌属、甲烷短杆菌属、甲烷八叠球菌属以及产甲烷马赛球菌属（Methanomassiliicoccus）普遍存在于反刍动物瘤胃中。经16S rRNA方法鉴定，甲烷短杆菌是最丰富的属（61.6%），另外两个丰富的属是甲烷微菌属（14.9%）和Methanomassiliicoccus（15.8%）[11-12]。1.3瘤胃真菌20世纪早期首次描述瘤胃真菌时将其归类为原生动物，后来Orpin[13]在1977年描述了它生命周期各个阶段和降解纤维素的作用，并重新分类为真菌。1986年，Wood等[14]研究得出动物瘤胃真菌有纤维素酶活性。2019年，Wang等[15]计算厌氧真菌的分化时间，发现与哺乳动物草食进化的估计时间相对应。形态学特征是分类真菌的关键，根据单中心或多中心菌丝，丝状或球状的形成，孢子囊的形状定义属。瘤胃真菌归属于新美鞭菌门、新美鞭菌纲、新美鞭菌目、新美鞭菌科，分胃梨囊霉属、盲肠鞭菌属、新丽鞭毛属、肠霉属、厌氧真菌属、厌氧鞭菌属、奥式霉属、蝴蝶菌属、布氏霉菌属等9个属和13个种[16]。到目前为止，前6个属已经被分离并鉴定[17]。据研究，胃梨囊霉属最丰富、最具有代表性[18]。1.4瘤胃原虫Gruby[19]在1843年首次报道了瘤胃原虫。瘤胃原虫分纤毛虫和鞭毛虫，其中纤毛虫的结构复杂、种类丰富，在瘤胃中占优势[20]。瘤胃纤毛虫属于纤毛门，根据形态分为全毛目和内毛目等2个目（通常分别称为Holotrich和Entodiniomorphids）[21]。最主要的属是内毛属和前毛虫属，约占90%[22]。瘤胃原虫虽然数量较少，但体积占优势，占微生物总量的20%~50%[23]。正常情况下，瘤胃内纤毛中的数量每天以2倍的速度增加。2瘤胃微生物的功能2.1瘤胃细菌的功能瘤胃细菌发酵后主要产生挥发性脂肪酸（VFA）、琥珀酸、甲酸及少量H2、乳酸和乙醇。附着在饲料颗粒上的细菌主要有助于纤维消化；而附着在瘤胃上皮的细菌会参与氧的清除。瘤胃细菌根据分解底物不同，分别有降解纤维素、半纤维素、脂肪、淀粉、蛋白和尿素等多种具有不同酶活性的细菌[24]。产琥珀酸丝状杆菌、黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌是代表性的纤维素分解菌，其中产琥珀酸丝状杆菌为革兰氏阴性菌，黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌为革兰氏阳性菌。主要的蛋白降解菌有嗜淀粉瘤胃杆菌、反刍瘤胃亚菌和双酶杆菌，主要的淀粉降解菌有琥珀酸弧菌、琥珀弧菌和反刍月形单胞菌。饲喂粗料比高的日粮时，革兰氏阴性菌是瘤胃中主要细菌，而高精料会使瘤胃中革兰氏阳性菌增加。能够降解饲料纤维素和半纤维素的细菌只占瘤胃总细菌数的0~4%，在反刍动物消化吸收植物性饲料时发挥极为重要的作用[25]。2.2瘤胃产甲烷菌的功能产甲烷菌利用碳基质（如CO2、甲酸盐、甲醇、甲胺、醋酸盐等）和H2形成CH4，不仅会导致能量损失（2%~12%），还会降低饲料利用率。产甲烷途径主要分为氢营养型、甲基营养型和乙酸型，其中氢营养性途径约占瘤胃甲烷总排放量的80%[23]。据研究，产甲烷菌能够利用不同底物产生甲烷是因为含有特殊的酶。为此Pitta等[25]构建了所有可能产甲烷的途径以及其利用的酶（见图1）。李斌昌等[26]发现，反刍动物瘤胃内产甲烷菌的总量与纤维降解菌的数量呈正相关，甲烷排放量与纤维素的分解呈正相关。动物甲烷的排放量与产甲烷菌总数无关，很大程度上依赖产甲烷菌群落的结构[27]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.030.F001图1产甲烷途径2.3瘤胃真菌的功能瘤胃真菌能够生成醋酸盐、丙酸盐、丁酸盐、H2、CO2、甲酸盐等代谢终产物[28]，虽只占瘤胃微生物的5%~20%，但其降解植物纤维素的能力远超细菌，可从植物中分解出50%以上的可发酵糖[16]。真菌不仅能够穿透牧草角质层进行物理性降解，还可分泌纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶等降解植物中的结构性多糖和非结构性多糖。据研究，真菌先深入生长到植物维管组织中使其变得疏松，之后其他纤维分解微生物才能分解纤维素[28]。化学性降解主要是利用多组分的纤维素酶，主要有C1、Cx和β-葡萄糖苷酶。C1-酶分解纤维素结构，在Cx-酶和β-葡萄糖苷酶的作用下水解为可溶物质。此外，瘤胃真菌的降解作用与其生活周期有关，约为24~32 h，包括瘤胃液中运动的游离孢子阶段和非运动的菌丝体阶段。具体表现为游离孢子开始附着于植物表面，并逐渐发育成为菌丝体，在非运动阶段，瘤胃真菌定植并降解纤维饲料。新丽鞭毛属和胃梨囊霉属降解秸秆能力较强，盲肠鞭菌属降解能力较弱。将瘤胃真菌与产甲烷菌共同培养可以提高植物降解酶的活性，而与细菌共同培养会抑制真菌分解纤维素的能力。反刍动物瘤胃真菌还具备分解蛋白质、淀粉和木质素的能力。瘤胃真菌不仅会分泌蛋白水解酶，还会在动物需要时会充当微生物蛋白，传递给宿主皱胃和肠道用于消化和吸收。Hess等[28]报道，虽然瘤胃真菌对动物菌体蛋白的贡献微乎其微，但真菌衍生蛋白质中必需氨基酸的组成却与反刍动物体内的蛋白相近，因此易被动物获取。瘤胃真菌还可生成α-淀粉酶和淀粉葡萄糖苷酶，并有许多研究已证实瘤胃真菌对淀粉的分解能力[29-30]。据报道，由于瘤胃真菌具有强大的穿透降解功能，主要附着于植物茎秆表面并深入维管，能够降解其他微生物无法分解的木质素[31]。在反刍动物日粮中添加厌氧真菌培养物可以提高采食量、生长速度和饲料效率[32-33]。2.4瘤胃原虫的功能瘤胃原虫发酵终产物与细菌类似，如乙酸、丁酸、H2N。据报道，瘤胃原虫具有明显的纤维素分解活性，其功能可能是由于与其他微生物协作完成或原虫自身的纤维降解酶（如内源性1,4-葡聚糖酶）[34-36]。一些原虫负责通过吞噬淀粉颗粒从而降低细菌对淀粉发酵引起的pH值变化。此外，瘤胃原虫不仅在瘤胃氨浓度较高时会降解饲料蛋白，还是动物微生物蛋白质的来源，能够增加反刍动物瘤胃饱腹感，具有较高的生物学价值[37]。瘤胃原虫可以清除瘤胃中的氧气，为其他微生物提供厌氧环境。瘤胃原虫会捕食其他微生物合成原虫所需的蛋白，并在发酵过程中调节其数量[38]。Bryant等[39]研究表明，去除犊牛瘤胃原虫，使细菌数量从6.0×109个/mL增加至13.6×109个/mL。Ozutsumi等[40]研究发现，驱除原虫组中的白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量基因提高3.5倍和2.0倍。但董瑞兰等[34]和Newbold等[37]研究表明，原虫能够促进细菌降解植物细胞壁，而且去除原虫可使纤维分解菌的数量显著降低。结果不同可能是因为一些细菌与原虫存在内外共生关系[41]，如Newbold等[37]研究表明，瘤胃中纤维降解非常复杂，需要多种纤维素分解菌极为复杂的互作，但其规律尚不清晰。原虫体内的氢化酶可将能量代谢的终末反应分隔释放氢，产生的氢会抑制原虫生长，而产甲烷菌有助于利用氢气产生甲烷，使瘤胃发酵正常进行，这一过程称为种间氢转移[42]。Tan等[43]的研究也证实了这一点，因此瘤胃原虫与产甲烷菌之间的结合方式是内外共生。据统计，附着于原虫表面的产甲烷菌占总甲烷菌的9%~37%，原虫胞液内产甲烷菌的比例远大于它们附着在表面的比例[44]。消除原虫能够减少9%~40%甲烷排放量[45]。据李宗军等[46]报道，长期驱除瘤胃原虫，甲烷排放量反而会显著增加。Orpin等[38]研究表明，原虫的运动可使真菌的活性增强。3瘤胃微生物定植规律胚胎时期以及刚出生后的动物消化道无菌，通过母体唾液、吸吮母乳、摄入日粮才逐渐建立了微生物群落[47]。母乳中糖和蛋白有助于初生动物建立胃肠道微生物区系[48]。反刍动物出生后的前14 d称为接触外来微生物阶段，第14~28 d称为微生物过渡时期，第28 d为内源性和外源性微生物的定植阶段[49]。最初初生动物瘤胃微生物分为好氧菌和兼性厌氧菌，40~60日龄时全部被厌氧菌取代。Fonty[50]研究发现，好氧细菌和兼性厌氧细菌最先建立，与Jami等[51]和Guzman等[52]检测得出1~2日龄反刍动物瘤胃中存在变形菌门和链球菌，随后很快被严格厌氧菌（纤维素分解菌和产甲烷菌）所取代的结论相符。随着宿主生长，变形菌门逐渐被拟杆菌门所取代，厚壁菌门从早期到成年均存在瘤胃中。在属水平上，随着固体饲料摄入量增加，普雷沃氏菌属成为反刍动物最优势菌属。Gagen等[53]在出生后17 h的羔羊瘤胃中检测到了产甲烷古菌。Friedman等[54]在1~2周龄的犊牛瘤胃内检测到了甲烷杆菌目、甲烷微菌目、甲烷八叠球菌目和甲烷原体目，但成熟瘤胃内只检测到甲烷杆菌目和甲烷原体目。真核厌氧真菌在出生后第8~10 d的羔羊瘤胃中被发现[50]。张科[55]发现，真菌在动物采食固体饲料前就开始在瘤胃内定植，14日龄前，子囊菌门为优势菌门，14日龄之后，新美鞭菌门成为优势菌门。原虫需要复杂的微生物菌群才能够建立，并会随着唾液在动物间转移，通常动物出生后2周左右时能够检测到原虫[56]。仔畜瘤胃原虫主要以鞭毛虫纲居多，而成年反刍动物的瘤胃原虫则以纤毛虫纲居多。据报道，动物刚出生时可溶性糖类迅速发酵形成挥发性脂肪酸，降低了瘤胃pH值，此时瘤胃中鞭毛虫发挥主要作用。而由于食物结构变化，瘤胃pH值会逐渐提高，也会促进纤毛虫繁殖。通过培养和分子方法检测哺乳期到断奶结束阶段羔羊瘤胃中微生物菌群的大致定植情况[57]，见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.11.030.F002图2羔羊瘤胃的微生物定植箭头表示定植时期开始。郭伟[58]研究显示，第7 d和第14 d牦牛瘤胃中检测到了细菌和古菌，4周龄左右时检测到了真菌和原虫。因此，反刍动物瘤胃微生物定植过程几乎一致。此外，古菌约在牦牛5岁时成熟，细菌、真菌和原虫于牦牛5~8岁间才能完全成熟。4结论瘤胃微生物为宿主转换营养物质，调控机体代谢。随着分子生物学技术的发展应用，深入揭示了以传统培养方法未能检测到的新物种，并进一步探究瘤胃微生物区系与反刍动物生命活动的相关性。新兴生物技术的发展可以充分了解瘤胃微生物群落，改善宿主的生产性能。