茶在饮食和药用方面的应用5 000多年的历史[1]。茶多糖是茶叶中具有生理活性功能的重要物质。植物多糖具有降低幼龄动物在断奶期间发生的氧化应激伤害和提高养殖物种的免疫抗病能力，在现代畜牧养殖、水产养殖中作为功能性添加剂而被广泛应用[2]。茶叶来源的多糖作为饲料添加剂，可以降低养殖成本，明显降低猪肉中胆固醇、脂肪含量，进而提高猪肉品质的作用[3]。在肉鸡的饲料中添加茶粉可以降低肉鸡的胆固醇含量，使肉仔鸡的脂肪沉积较少、氧化谱减少，还可以代替抗生素生长促进剂且对肉鸡无毒副作用[4]。与绿茶、红茶相比，黑茶的原料较为粗老并含有一定的老茶梗，因此黑茶的多糖含量要高于绿茶、红茶[5]。黑茶在后发酵过程中，茶多酚、茶红素、黄酮类物质大幅度下降，但茶多糖的含量升高。因此，黑茶是研究茶多糖的良好原料来源。茶多糖的提取通常选择热水作为提取溶剂。该方法操作简便、易于扩大化生产。超声波或微波辅助提取有利于缩短提取时间但会破坏茶多糖的结构。此外，茶多糖的提取还有稀碱提取法、稀酸提取法和酶解法等。目前，六堡茶多糖的提取工艺还未统一，国内外关于六堡茶多糖的最佳提取条件的研究较少，不利于开发六堡茶多糖成为饲料添加剂。本研究采用经典的水提醇沉法提取六堡茶多糖。通过响应面试验考察浸提时间、料水比和提取温度对茶多糖得率的影响，确定最佳的提取条件，并测定纯化后的多糖组分。文章将会给六堡茶多糖的标准化提取工艺提供参考。1材料与方法1.1材料与仪器试验材料：六堡茶（批号：2607），六级茶，购自梧州中茶茶业有限公司。试验仪器：可见分光光度计（722N）购自上海仪电分析仪器有限公司；旋转蒸发仪（RE-52AA）购自上海亚荣生化仪器厂；数显式恒温水浴锅（BLHH-6N）购自上海丙林电子科技有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9146A）购自上海精宏试验设备有限公司。1.2试验方法1.2.1六堡茶多糖的分离提取及初步纯化六堡茶多糖的提取工艺参照Chen等[6]方法。六堡茶粉碎后过30目的筛子，加入90%的工业酒精，液料比为15 mL/g，沉淀24 h。收集滤渣，挥干酒精后每克滤渣加入15 mL的蒸馏水，在70 ℃下提取2 h。过滤，收集滤液，浓缩至原体积的10%。浓缩液加入4倍体积的95%的乙醇溶液，沉淀24 h。收集沉淀，分别使用乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀3次。将洗涤后的沉淀复溶于水，采用Sevag法除蛋白，聚酰胺静态脱色素。上清液透析（8 kDa），冷冻干燥，即得到六堡茶多糖。1.2.2单因素试验因素水平（见表1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.T001表1单因素试验因素水平水平液料比/(mL/g)时间/min温度/℃155030210606031570904208012052590150为研究不同提取因素和同一提取因素的不同水平对六堡茶多糖提取率的影响，试验选择对茶多糖提取率影响较大的因素（浸提时间、料水比和提取温度）进行分析，每个因素选取5个水平，确定单个因素的最优提取条件。1.2.3Box-Behnken模型的中心组合试验设计根据Box-Behnken模型的中心组合试验设计原理[7]，以单因素试验结果为参考依据，选择浸提时间、料水比和提取温度对六堡茶多糖影响显著的三因素，采用3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验，试验因素与水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.T002表2试验因素与水平因素F1时间/minF2液料比/(mL/g)F3温度/℃-1601060090157011202080采用Design-Expert 12.0软件设计对浸提时间F1、料水比F2和提取温度F3做如下变换：X1=(F1-90)/10(1)X2=(F2-15)/5(2)X3=(F3-1.5)/0.5(3)式中：Xl，X2，X3为自变量，以六堡茶多糖提取率（Y）为响应值。验证试验的方法为，取3份六堡茶样品，每份100 g，在响应面优化得到的最佳工艺优化参数下提取茶多糖，计算得率，与响应面法预测的最大提取率进行分析比较。1.2.4六堡茶多糖化学成分指标测定采用苯酚-硫酸比色法[8]测定中性糖含量；采用考马斯亮蓝G-250法[9]测定蛋白质含量；采用苯酚-咔唑比色法[10]测定糖醛酸含量；采用酒石酸亚铁比色法[11]测定茶多酚含量。2结果与分析2.1六堡茶多糖提取的单因素试验2.1.1浸提时间对六堡茶多糖提取效果的影响（见图1）由图1可知，在固定液料比为15 mL/g和提取温度70 °C时，六堡茶多糖得率随着浸提时间的延长而逐渐增加。浸提120 min后，六堡茶多糖得率增加减缓，150 min时得率增加不明显。说明六堡茶多糖与浸提液之间已经达到扩散平衡，继续浸提对六堡茶多糖提取率的影响不明显，所以采用浸提时间为120 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.F001图1浸提时间对六堡茶多糖提取效果的影响2.1.2液料比对六堡茶多糖提取效果的影响（见图2）由图2可知，在固定浸提时间120 min和提取温度70 ℃时，液料比增加，多糖的得率也随之增加。液料比在10~25 mL/g之间，六堡茶多糖得率变化幅度不明显。由于液料比过高可能会降低所提取的多糖纯度并且不利于后续的浓缩工艺，故液料比不宜过大。因此，确定液料比为15 mL/g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.F002图2液料比对六堡茶多糖提取效果的影响2.1.3提取温度对六堡茶多糖提取效果的影响（见图3）由图3可知，在固定浸提时间为120 min和液料比为15 mL/g时，六堡茶多糖的得率因为提取温度的加大而升高。温度升高多糖容易浸出，但也有可能多糖的结构在高温下被破坏，因此确定温度为70 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.F003图3提取温度对六堡茶多糖提取效果的影响2.2二次响应面分析法在六堡茶多糖提取工艺优化中的应用综合单因素试验结果，以浸提时间、液料比和提取温度等显著影响因素为自变量，采用Box-Bebnken的中心组合试验设计对这些因素进行15组试验，以茶多糖得率为响应目标，进行响应面优化试验，响应面试验设计方案与结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.T003表3响应面试验设计方案与结果试验号X1X2X3实测值预测值1-1-108.478.232-1108.898.9931-1010.2110.11411010.8111.0550-1-17.857.9460-118.128.37701-19.248.9980119.129.039-10-18.218.361010-110.2410.2511-1018.548.531210110.7110.56130009.799.70140009.629.70150009.689.70采用Design-Expert软件对试验结果进行二次响应面回归分析，得到六堡茶多糖得率对浸提时间、液料比和提取温度的二次多项式回归模型为：Y=-28.645 42-0.054X1+0.761 250X2+0.929 542X3+0.000 3X1X2+0.000 117X1X3-0.001 95X2X3+0.000 412X12-0.018 883X22-0.006 421X32 (4)运用软件对模型进行方差分析，考察模型的可靠性，拟合二次多项式模型的回归统计分析结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.T004表4拟合二次多项式模型的回归统计分析结果参数平方和自由度均方F值P值Model12.280 091.360 020.140 00.002 1A时间7.720 017.720 0113.990 00.000 1B液料比1.450 011.450 021.450 00.005 7C温度0.112 810.112 81.670 00.253 4AB0.008 110.008 10.119 60.743 6AC0.004 910.004 90.072 30.798 7BC0.038 010.03800.561 30.487 5A20.506 610.506 67.480 00.041 1B20.822 910.822 912.150 00.017 6C21.520 011.520 022.470 00.005 1残差0.338 750.067 7失拟项0.323 930.108 014.520 00.065 1纯误差0.014 920.007 4总和12.620 014R2 = 0.973 2C.V.值=2.8信噪比=14.627 9由表4可知，本试验建立的模型的P值显著，具有统计学意义。校正决定系数R2为0.973 2，表明模型响应值的变化有97.32%来自所选因变量，即浸提时间、液料比和提取温度，说明模型中试验值与预测值拟合优度较好。利用Design-Expert 12.0软件做出以六堡茶多糖得率（Y）为指标的三维空间响应面图和等高线图，见图4~图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.F004图4浸提时间与液料比对六堡茶多糖提取率影响的响应面10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.F005图5浸提时间与提取温度对六堡茶多糖提取率影响的响应面10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.F006图6液料比与提取温度对六堡茶多糖提取率影响的响应面由图4~图6可知，六堡茶多糖的最佳提取工艺参数为：浸提时间120 min、液料比16.45 mL/g、提取温度70.83 ℃，六堡茶多糖的最佳提取率为11.03%。采用响应曲面分析优化后的最佳提取工艺条件来提取六堡茶多糖，由于考虑到六堡茶多糖提取步骤操作的方便性，将最佳提取工艺条件调整为浸提时间120 min、液料比15 mL/g、提取温度70 ℃。根据调整后的工艺实施了3次验证试验，结果表明，六堡茶多糖平均提取率为10.81%，与理论值的误差在2%以内，说明响应面法优化六堡茶多糖的提取工艺条件具有实用价值。2.3六堡茶多糖的主要化学成分（见表5）由表5可知，六堡茶多糖中中性糖和糖醛酸是其主要成分，此外还含有16.37%的蛋白质和2.5%的多酚，说明六堡茶多糖是与蛋白质缀合的酸性多糖。真空冷冻干燥后的六堡茶多糖为浅棕色层状固体，溶于水，不溶于高浓度的有机溶剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.014.T005表 5六堡茶多糖的主要化学成分样品中性糖蛋白质糖醛酸多酚六堡茶多糖33.6116.3735.092.50%3讨论从茶叶中提取茶多糖是纯化的第一步，也是研究茶多糖活性的基础。文章确定六堡茶多糖的最佳提取条件是浸提时间120 min、液料比15 mL/g、提取温度70 ℃。袁勇等[12]报道，茶多糖的最佳提取温度在60 ℃到85 ℃，与本文的结论一致。Chen等[13]在料液比为1∶10的条件下提取黑茶多糖，试验结果表明料液比1∶10时，六堡茶多糖的得率偏低，而过高的水料比会给后续的浓缩步骤带了困难，因此确立最佳水料比为1∶15。Xie[14]通过响应面法得到六堡茶多糖的最佳提取工艺为料液比1∶17，提取时间83 min、提取温度93 ℃，然而得率较低为8.0%。本试验结果的六堡茶多糖的得率为10.81%，高于已有报道。通过测定茶多糖的中性糖、糖醛酸、蛋白质和多酚的含量可对茶多糖的化学组分进行分析。Mao等[15]在相同的提取条件下，得到的六堡茶多糖含有50.71%的中性糖和21.97%的糖醛酸，碳水化合物含量为72.68%。本试验所提取的多糖中性糖占33.61%，糖醛酸占35.09%，碳水化合物占68.07%，略小于Mao等[15]的结论。这可能是因为原料的差异。Mao等[15]使用的是三级茶，本试验选用的是六级茶。汪东风等[16]通过分析绿茶、红茶的多糖含量，认为级别越低的茶叶多糖含量越高。然而，陈玉琼等[17]通过比较同一茶树品种的不同生长时期的茶叶，认为茶多糖的含量会随着茶叶变老而逐渐降低。因此，茶多糖含量的高低不仅与等级有关，或许还与茶树本身有关。本试验中检测出六堡茶多糖含有的糖醛酸为35.09%，高于应乐等[18]检测的六堡茶多糖中糖醛酸含量（24.46%~29.65%）。Chen等[19]报道黑茶的蛋白质含量在（4.23%~19.90%）之间，与本试验六堡茶多糖的蛋白质含量（16.37%）相吻合。糖醛酸和蛋白质含量高的茶多糖或许与茶叶的生理活性相关[19]。因此，此条件下提取的六堡茶多糖可能有较好生理活性。六堡茶多糖的中性糖、糖醛酸及蛋白质含量达到80%以上，此外还含有少量多酚类物质（2.5%）。马婉君等[20]研究表明，多酚类是六堡茶抗氧化功能的主要成分。六堡茶多酚的含量或许与原料及制作工艺有关，六堡茶散茶和砖茶的多酚含量分别为13.1%和9.5%。4结论文章通过单因素试验结合Box-Behnken模型，建立二次响应面分析，确立了六堡茶多糖的最佳提取工艺参数为浸提时间120 min、液料比15 mL/g、提取温度70 ℃。根据此优化条件进行3次验证试验，六堡茶多糖平均提取率为10.81%。六堡茶多糖主要化学成分是总糖占33.61%、蛋白质占16.37%、糖醛酸占35.09%、多酚类占2.50%。研究优化六堡茶的提取工艺，测定六堡茶多糖的组分中含有较多活性物质，试验结果证明，六堡茶多糖具有进一步开发成为饲料添加剂的潜能。