泌乳前期高产奶牛的产奶量迅速增加，但其采食的营养并不能满足产奶所需要的能量，因此需要动员体脂进行供能，导致奶牛体况下降，引发一系列代谢性疾病，危害奶牛机体健康和正常泌乳[1]。近年来，使用植物提取物调控动物对营养物质的消化和代谢已经成为研究热点。研究发现，蒿属植物提取物具有调节机体代谢、促进反刍动物瘤胃发酵和促进饲料营养吸收的作用[2]。余诗强等[3]研究发现，奶牛日粮中添加0.75%青蒿提取物能够促进瘤胃发酵，显著提高挥发性脂肪酸（VFA）含量，降低瘤胃乙丙比。苏汉书等[4]体外试验发现，日粮中添加0.5%青蒿提取物能降低奶牛瘤胃中甲烷（CH4）产量，提高瘤胃液中氨氮（NH3-N）浓度和丙酸含量。顾小卫[5]在奶牛日粮中添加 600 g/头艾蒿粉，显著降低了瘤胃液中NH3-N浓度，提高菌体蛋白(BCP)的合成量和VFA含量。黑沙蒿是一种优良的固沙类灌木，广泛分布于我国西北方地区，能够耐干旱和恶劣环境，富含多糖类、黄酮类和有机酸类等生物活性成分[6]。目前，对黑沙蒿的研究多集中在其对鸡、大鼠等单胃动物的免疫抗氧化及生产性能的影响方面[7-8]，有关在奶牛生产中添加黑沙蒿的研究报道较少。因此，本试验通过体外瘤胃发酵技术，研究奶牛日粮中添加不同剂量的黑沙蒿水提物对瘤胃发酵功能的影响，为奶牛饲养试验筛选适宜的黑沙蒿添加剂量，也为黑沙蒿资源在奶牛生产中的合理使用提供参考。1材料与方法1.1黑沙蒿水提物黑沙蒿采自内蒙古鄂尔多斯市境内，于7月份刈割，自然阴干1~2周，将黑沙蒿茎、秆、叶切碎至1.5 cm左右，混合均匀，称取样品，与蒸馏水按照1∶15混合，于70 ℃恒温水浴锅熬煮4 h，待过滤后将滤液通入日本东京理化株式会社（EYELA N-1300型）旋转蒸发仪进行浓缩，将浓缩液于-80 ℃冻干，制成干粉后进行试验。1.2瘤胃液供体动物试验选取3头体况、年龄、胎次、产奶量、泌乳时期及生理状态相近的健康干奶期荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体动物，于晨饲前进行瘤胃液采集。1.3试验设计采用单因素完全随机试验设计，选取3头奶牛为瘤胃液供体动物，通过口腔采集瘤胃液，经过2层纱布过滤到提前预热，通入CO2的保温壶中，将3头牛瘤胃液进行混合，用于制备培养液。对照组、H1组、H2组、H3组、H4组分别在发酵底物中添加0、0.025%、0.050%、0.075%和0.100%黑沙蒿水提物，每组6个重复。发酵底物为内蒙古呼和浩特市沙梁牧场泌乳期奶牛TMR日粮。日粮干物质基础粗蛋白含量为17.04%，粗脂肪含量为4.45%，酸性洗涤纤维含量为21.91%，中性洗涤纤维为37.15%，钙含量为1.06%，磷含量为0.49%。体外培养24 h后测定瘤胃发酵参数、挥发性脂肪酸含量及发酵气体成分。1.4体外瘤胃液培养法参考Menke等[9]方法配制缓冲液，准确称取1 g混匀的TMR日粮，加入100 mL发酵瓶中，39 ℃预热。向缓冲液中持续通入CO2，待溶液变为无色时，将瘤胃液与缓冲液按1∶2混合，分别加入含有发酵底物的培养瓶中，培养体系为60 mL。使用ANKOM RFS全自动产气记录仪（北京安科博瑞科技有限公司）测定发酵产气量；发酵24 h，及时终止发酵，将发酵瓶中滤液分别取样，测定瘤胃发酵指标。将同样处理条件下的培养瓶连接集气袋，置于39 ℃恒温气浴摇床培养24 h收集气体，测定发酵气体中甲烷（CH4）、CO2和氢气（H2）含量。1.5测定指标及方法1.5.1瘤胃发酵参数采用CT-6022型手持便携式pH计测定瘤胃液pH值，采用考马斯亮蓝法[10]测定瘤胃液中菌体蛋白（BCP）含量，采用比色法[11]测定瘤胃液中氨态氮（NH3-N）含量；参考王加启[12]的方法进行原虫计数。采用气相色谱法[13]测定挥发性脂肪酸（VFA）含量，使用岛津（GC-2014）气象色谱仪，以二乙基丁酸为内标，计算总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度。1.5.2气体成分参考文献[14]至文献[15]中体外法，使用泰特仪器（GC-2030）气相色谱仪测量收集的气体样本中的CH4、CO2、H2含量，配备碳球80/100柱和热导检测器。色谱柱、进样器和氢火焰离子化检测器的温度分别设置为60、220、70 ℃。氮气和氢气分别用作载气和燃烧气体。用已知成分的标准气体作为外标物（伟创标准气体分析技术有限公司），标准气体含30.2%mol/mol CH4，67.8% CO2，其余为H2，用于构建标准曲线，量化CH4、CO2、H2含量，待测气体上样量为1 mL。在连续气体样本之间每隔1.5 h注入标准气体（按照收集发酵气体样品的相同程序收集标准品气体样品），以验证GC气体成分读数是否正常。1.6数据统计与分析试验数据采用Excel 2021进行计算与整理，SAS 9.2软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误（SEM）表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响（见表1）由表1可知，与对照组相比，H1组、H2组、H3组、H4组奶牛瘤胃液pH值和NH3-N含量均显著降低（P0.05），BCP含量显著增加（P0.05）；H2组、H3组、H4组奶牛瘤胃液NH3-N含量差均显著低于H1组（P0.05），H3组奶牛瘤胃液BCP含量显著高于H4组（P0.05），H1组、H2组、H4组BCP含量差异不显著（P0.05）。H3组、H4组奶牛瘤胃液原虫数量显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.002.T001表1黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响项目pH值NH3-N/(mg/L)BCP/(mg/L)原虫数量/(ⅹ104个/mL)对照组6.49a203.63a109.26c6.13aH1组6.40b194.93b117.91ab6.00aH2组6.39b180.92c121.76ab6.10aH3组6.39b178.77c125.35a4.92bH4组6.37b179.02c113.22b4.80bSEM0.012.383.030.77P值＜0.001＜0.0010.0070.028注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃发酵气体成分的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，H2组、H3组、H4组奶牛瘤胃发酵产气量显著提高（P0.05），H1组、H2组、H3组奶牛瘤胃二氧化碳含量显著提高（P0.05），H3组二氧化碳含量显著高于H4组（P0.05）。H1组、H2组、H3组奶牛瘤胃氢气含量显著低于对照组（P0.05），H4组氢气含量显著高于H3组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.002.T002表2黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃发酵气体成分的影响项目产气量/mL甲烷/%二氧化碳/%氢气/%对照组262.33c8.0888.44c3.48aH1组266.58c8.0589.63ab2.21bcH2组276.33ab8.2589.76ab1.98bcH3组279.67a8.1790.04a1.42cH4组271.83b7.9889.01bc2.69abSEM1.780.000.000.00P值＜0.0010.8580.0050.0012.3黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃液挥发性脂肪酸的影响（见表3）由表3可知，H2组和H3组乙酸、丙酸、戊酸和总挥发性脂肪酸浓度显著高于对照组（P0.05）。H3组异戊酸含量显著高于其他各组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.002.T003表3黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃液挥发性脂肪酸的影响项目乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)异丁酸/(mmol/L)丁酸/(mmol/L)异戊酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)乙丙比总挥发性脂肪酸/(mmol/L)对照组40.911c17.253c0.701b7.088b1.142b1.052b2.37168.147cH1组41.460abc17.337bc0.708ab7.164ab1.180b1.061b2.33468.603bcH2组41.977ab17.979a0.711ab7.219ab1.187b1.101a2.28970.175abH3组42.268a18.203a0.729a7.429a1.234a1.102a2.28170.965aH4组41.063bc17.941ab0.711ab7.215ab1.172b1.037b2.23269.139bcSEM0.3090.2080.0070.0930.0160.0110.2080.458P值0.0200.0110.1580.1500.0060.0010.2950.0023讨论3.1黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃发酵参数的影响瘤胃是反刍动物重要的消化器官，瘤胃液pH值可以直接反映瘤胃健康状态和发酵功能的完整性以及瘤胃发酵过程中各组营养物质消化降解和有机酸类代谢情况[16]。奶牛瘤胃液正常pH值范围在5.5~6.8[17]。pH值保持在正常范围内对瘤胃微生物正常生长、繁殖和代谢具有重要作用，常常受日粮组成和添加剂类型的影响。体外试验中，NH3-N的释放与转化及各种有机酸和CO2的生成是影响瘤胃液pH值的因素。马国强等[18]在体外瘤胃发酵试验中发现，添加黑沙蒿多糖可以显著降低山羊瘤胃液中NH3-N浓度和pH值。本试验结果表明，黑沙蒿水提物添加组奶牛瘤胃液pH值显著低于对照组，且均处于正常生理范围内，黑沙蒿水提物添加剂量为0.025%~0.075%时，瘤胃液中CO2、乙酸含量显著升高，NH3-N浓度显著降低，导致瘤胃液pH值下降。瘤胃中NH3-N是微生物菌体蛋白合成的原料，主要来源于食糜中的蛋白质和非蛋白氮的降解，其含量是反映瘤胃微生物生长情况的重要指标之一。奶牛瘤胃微生物生长的NH3-N含量是100~500 mg/L[19]。瘤胃NH3-N含量过低会导致微生物缺少合成蛋白的原料，进而降低BCP产量，含量过高表明氨的生成量已经超过微生物对其转化利用的能力，造成了摄入饲料中氮的浪费，如果无法及时排出还会引起反刍动物发生氨中毒，影响动物健康和生产性能。BCP是瘤胃内微生物利用瘤胃中的氮源合成的生物蛋白，营养价值较高，瘤胃中NH3-N与BCP含量密切相关，瘤胃内80%的细菌可以利用NH3-N作为唯一氮源合成BCP[20]。日粮中蛋白质降解产生的氨、小肽和游离的氨基酸也会被瘤胃中厌氧微生物认为是氮源，以饲粮中发酵糖类生成CO2的和VFA作为碳架，利用生成的能量合成BCP，其合成量直接反映瘤胃中细菌数量和利用NH3-N合成微生物蛋白的效率[21]。本试验中，黑沙蒿水提物组奶牛瘤胃BCP含量均显著高于对照组，瘤胃液中NH3-N均显著降低，与0.075%黑沙蒿水提物组BCP含量显著高于0.1%组。由此可以推测，添加适宜剂量的黑沙蒿水提物能够明显提高瘤胃微生物的活性，提高NH3-N被利用合成BCP效率。瘤胃中的原虫与细菌处于动态平衡中，原虫只能通过吞噬细菌间接利用氮，获得自身需要的氨基酸用于蛋白质的合成。因此，原虫对细菌的氮代谢具有重要的调节作用。原虫本身在代谢过程中会分泌脱氨酶并不断释放NH3，因此原虫是NH3的净生产者，这也是去除原虫后NH3-N含量降低的原因[22]。有研究表明，瘤胃细菌与原虫密切相关，降低原虫数量可以提高瘤胃细菌数量，促进BCP的合成[23]。本试验发现，与对照组相比，添加0.075%和0.1%的黑沙蒿水提物组显著降低了原虫数量，使更多的细菌参与合成BCP。3.2黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃发酵气体成分的影响瘤胃发酵产气量可以直接反映瘤胃发酵剧烈程度。瘤胃微生物群落降解摄入的食糜，产生CO2、H2、VFA和甲酸盐等合成甲烷的前提物质[24]。H2是瘤胃发酵过程重要的中间产物，在葡萄糖分解和丙酮酸氧化脱羧过程中产生，主要通过CH4合成途径排出体外[25]。奶牛瘤胃中CO2主要由糖发酵和氨基酸脱羧产生，而瘤胃中CH4主要由CH4合成菌利用H2和CO2等物质经过一系列化学反应合成[26]。由于产CH4菌合成甲烷会消耗能量和碳量，造成瘤胃生成VFA减少，奶牛会通过嗳气将CH4排出体外，造成瘤胃中2%~12%的总能摄入量损失[27]。本试验结果表明，添加0.05%~0.10%黑沙蒿水提物时，奶牛瘤胃发酵产气量和CO2含量显著高于对照组，0.1%黑沙蒿水提物组产气量和CO2含量明显低于0.075%组，表明添加适宜剂量的黑沙蒿水提物可以提高瘤胃微生物活性，提高饲料分解效率，进而增加产气量。本试中，添加0.075%黑沙蒿水提物组奶牛瘤胃中CO2含量明显上升，合成的碳酸增多，NH3-N浓度明显降低，是引起瘤胃液中原虫数和pH值显著下降的原因之一。CO2和H2作为CH4重要的合成底物，其含量上升说明添加黑沙蒿水提物促进了瘤胃发酵，但CH4含量并未随CO2增多而变化。有研究表明，附着在瘤胃原虫上的产甲烷菌数量占总甲烷菌数量的9%~25%，抑制原虫后能够明显降低瘤胃甲烷产量[28]。本试验发现，添加0.075%~0.100%的黑沙蒿水提物会明显降低瘤胃中原虫数量。因此，可推测添加黑沙蒿水提物可能抑制产CH4菌的数量或活性，使其无法利用不断增多的底物合成CH4，进而引起瘤胃中其他代谢途径竞争氢，使更多的能量和碳源流向后肠道，具体机理需要进一步研究探讨。3.3黑沙蒿水提物对奶牛体外瘤胃液挥发性脂肪酸的影响瘤胃中VFA是反刍动物主要的能量来源，由摄入的碳水化合物发酵产生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸等[29]。乙酸、丙酸和丁酸约占总挥发性脂肪酸浓度95%以上。动物肝脏可以通过糖异生作用将丙酸生成葡萄糖为机体提供能量，随着丙酸合成量升高，可为机体提供的能量也升高[30]。反刍动物瘤胃中的诸多有机酸合成过程会与CH4合成竞争氢，如丙酸合成与CH4具有共同代谢底物，因此可以通过促进丙酸合成竞争氢，进而降低CH4合成，从而为机体提供更多的能量，减轻合成CH4过程造成的奶牛能量代谢损失[31]。异戊酸与异丁酸可以明显提高瘤胃纤维素酶活性，促进瘤胃对摄入日粮中营养物质的消化[32]。乙酸是乳脂肪合成的主要碳骨架,是脂肪酸从头合成的重要底物。研究表明，反刍动物瘤胃中VFA含量与能量转化效率呈正相关，与瘤胃液pH值呈负相关[33]。有研究报道，在山羊日粮中添加青蒿提取物可以显著提高其瘤胃中乙酸、丙酸、丁酸和TVFA含量，促进瘤胃发酵，为后肠道输送更多的能量物质[34]。本试验结果表明，添加0.05%~0.075%的黑沙蒿水提物可以显著提高乙酸、丙酸、戊酸和TVFA含量，为机体糖异生供能及乳脂合成提供更多的底物。H2作为甲烷及丙酸合成的共同前体物，随着丙酸合成量增加，导致发酵气体中H2被摄取，竞争性抑制CH4生成，瘤胃液pH值也随着丙酸等有机酸含量上升而明显下降。这也与该添加剂量瘤胃液pH值变化规律相吻合，添加0.075%的黑沙蒿水提物可以明显提高瘤胃内异戊酸含量，表明添加0.050%~0.075%的黑沙蒿水提物可以促进瘤胃发酵功能，提高瘤胃液中VFA含量，降低乙丙比，进而为奶牛提供更多的能量来源，用于代谢和生产。4结论在体外发酵底物中添加0.050%~0.075%的黑沙蒿水提物可以显著促进奶牛瘤胃发酵功能，以0.075%添加量效果较好。