蛋白饲料价格持续上涨，低蛋白质日粮逐渐成为发展趋势，但低蛋白日粮可对动物生长产生负效应，因而需要补充低蛋白质氨基酸平衡日粮。目前，有关低蛋白质氨基酸平衡日粮的研究多集中于赖氨酸（Lys）、蛋氨酸（Met）和苏氨酸（Thr）等限制性氨基酸，从而满足动物生长发育需要[1]。犊牛要经历瘤胃发育的特殊时期，其营养需要具有特殊性[2]，尤其犊牛断奶后发育更加迅速，消化方式发生改变使到达小肠的氨基酸（AA）数量和种类发生巨变，导致AA缺乏。因此，关于犊牛氨基酸营养的研究十分重要。功能性氨基酸色氨酸（Trp）、支链氨基酸（BCAA）是限制性氨基酸[3]。亮氨酸（Leu）不仅可作为各种代谢途径（如蛋白质合成）的底物，对mRNA翻译也起到重要的调节功能[4]。桑丹等[5]发现，Leu可通过对mTOR信号传导通路的影响，促进骨骼肌蛋白质合成。郑辰[6]发现，在日粮中添加Leu可提高荷斯坦犊牛必需氨基酸（EAA）和能量可利用水平，并通过激活mTOR及其下游信号分子S6K1和4EBP1促进翻译起始，进而促进犊牛骨骼肌的蛋白质合成及其发育。作为一种功能性氨基酸，Trp及其代谢产物对动物机体采食量、蛋白质的沉积以及消化吸收功能具有正效应，进而提高生长性能、增强免疫功能以及抗应激能力[7]。江敏[8]发现，日粮中补充Trp可提高断奶仔猪血液抗氧化水平，促进肠道中抗氧化酶基因表达。本试验研究低蛋白质日粮中补充Leu和Trp对断奶期犊牛生长性能、血液参数、断奶应激的影响，旨为替代高蛋白日粮的应用开发提供参考。1材料与方法1.1试验设计与饲养管理本试验于2022年6—8月在河北省君乐宝君凯牧业威县有限公司进行。试验动物饲喂开食料（由亿如科技公司加工制作，其中亮氨酸和色氨酸纯度均为99%）。选取健康状况良好、初生重（42±2）kg的中国荷斯坦犊牛，采用完全随机试验设计，将犊牛按照初生重随机分为5组，每组12头犊牛，分别为HK组（饲喂22%蛋白质水平的开食料）、LK组（饲喂19%蛋白质水平的开食料）、L组（饲喂19%CP水平、含有1.15% Leu的开食料）、T组（饲喂19%CP水平、含有0.26% Trp的开食料）、LT组（饲喂19%CP水平、含有1.15% Leu+ 0.26% Trp开食料）。试验期72 d。犊牛出生后，2 h内饲喂4 L初乳，12 h内再饲喂2 L；2日龄后，每日7：30、17：30饲喂常乳；犊牛2~9日龄每天每头饲喂牛乳6 L；10~59日龄每天每头饲喂牛乳12 L；60~64日龄每天每头饲喂牛乳依次递减2 L；65日龄正式断奶。牛乳经巴氏消毒后饲喂。每日8：00、18：00加电解质水2次，犊牛自由饮水，自由采食不同成分的开食料以及燕麦干草。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.001.T001表1基础日粮组成及营养水平（干物质基础）项目HK组LK组L组T组LT组原料组成/%玉米44.2749.9647.4449.7447.57豆粕15.2415.2415.2415.2415.24膨化全脂大豆10.4510.4510.4510.4510.45棉粕14.126.866.826.967.04麸皮4.144.034.894.154.87玉米胚芽粕6.535.976.525.715.93甜菜颗粒1.001.001.001.001.00葡萄糖1.001.001.001.001.00磷酸氢钙0.150.200.200.200.20石粉1.601.551.551.551.55食盐0.500.500.500.500.50预混料1.001.001.001.001.00赖氨酸01.671.671.671.67蛋氨酸00.570.570.570.57亮氨酸001.1501.15色氨酸0000.260.26合计100.00100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白质/%22.3719.1519.2119.2519.22粗脂肪/%4.204.304.304.264.23中性洗涤纤维/%14.7613.3313.6613.2813.48酸性洗涤纤维/%6.495.515.635.505.59代谢能/(MJ/kg)11.2111.1511.1111.1311.13注：1.预混料为每千克日粮提供：VA 12 000 IU、VD 4 000 IU、VE 50 IU、Fe 100 mg、Zn 80 mg、Mn 40 mg、Cu 10 mg、I 0.50 mg、Se 0.30 mg、Co 0.10 mg。2.营养水平均为实测值。1.2测定指标及方法1.2.1生长性能于犊牛65日龄（断奶当天）和72日龄（断奶后1周）晨饲前称重，试验期间每天记录每只犊牛的投料量和剩料量，计算平均日增重、平均日采食量、料重比。平均日增重=(72日龄重-65日龄重)/(犊牛头数×试验天数)(1)平均日采食量=(投料量-剩料量)/(犊牛头数×试验天数)(2)料重比=平均日采食量/平均日增重(3)1.2.2血清生化指标于犊牛62日龄（断奶前3 d）、65日龄（断奶当天）、68日龄（断奶后3 d）晨饲前，每组随机选择8头犊牛，颈静脉采血，分离血清（3 500 r/min），-20 ℃保藏。采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定血清生化指标：葡萄糖（GLU）、粗蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、生长激素（GH）、结合珠蛋白（Hpt）、皮质醇（Cort）、溶酶菌（LYS）、碱性磷酸酶（ALP）活性。操作方法严格按照试剂盒说明书进行。1.2.3血清免疫指标采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定血清免疫指标：免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）；血清炎症因子：干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）。操作方法严格按照试剂盒说明书进行。1.2.4血清抗氧化指标采用试剂盒（南京建成生物工程研究所）测定血清抗氧化指标：丙二醛（MDA）、总抗氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）。操作方法严格按照试剂盒说明书进行。1.3数据统计与分析试验数据采用Excel软件进行整理，SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛生长性能的影响（见表2）由表2可知，与HK组相比，LK组犊牛65日龄重、平均日增重、平均日采食量和料重比显著降低（P0.05）。与LK组相比，T组、LT组犊牛2日龄重、平均日采食量显著升高（P0.05）；L组、T组、LT组平均日增重显著升高（P0.05）；T组平均日采食量显著升高（P0.05）。LK组断奶犊牛料重比显著高于L组、T组、LT组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.001.T002表2低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛生长性能的影响项目65日龄重/(kg/头)72日龄重/(kg/头)平均日增重/[kg/(头·d)]平均日采食量/[kg/(头·d)]料重比HK组96.57100.51a0.66a1.54a2.59bLK组93.5095.19b0.28b1.22b4.60aL组96.50100.57a0.68a1.38ab2.09bT组94.2598.38ab0.69a1.48a2.52bLT组97.43101.94a0.75a1.46a2.91bSEM0.640.750.610.320.13P值0.200.010.050.010.04注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字表示差异不显著（P0.05）。2.2低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛血清生化指标的影响（见表3）由表3可知，62日龄时（断奶前3 d），与LK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清TP含量显著升高（P0.05），LT组断奶犊牛血清BUN含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.001.T003表3低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶期犊牛血清生化指标的影响项目HK组LK组L组T组LT组SEMP值GLU/(mmol/L)62日龄8.188.099.5310.188.990.440.5665日龄8.768.318.659.278.750.580.9968日龄9.697.4010.269.219.190.530.52TP/(g/L)62日龄74.98ab72.03b73.69ab76.81a77.07a0.620.0465日龄75.80ab72.68b72.84b76.62a77.40a0.630.0268日龄72.58b71.76b72.40b74.12ab77.42a0.650.02ALB/(g/L)62日龄45.9843.5644.7446.4445.931.180.4865日龄45.1444.0243.6445.3845.401.550.7768日龄41.6242.5341.9042.7245.221.350.64GLB/(g/L)62日龄29.0028.4728.9530.3731.141.040.9365日龄30.6628.6629.2031.2432.001.500.9768日龄30.9629.2330.5031.4032.201.310.78BUN/(mmol/L)62日龄7.77ab8.55a8.49a7.50ab6.58b0.230.0465日龄6.91ab7.94a6.94ab5.83bc4.86c0.330.0268日龄7.717.757.727.707.560.580.99ALP/(U/L)62日龄94.4988.2589.89106.19108.545.120.3865日龄91.9681.05101.89108.22113.325.940.5068日龄105.55100.06100.92116.32117.385.030.75Cort/(μg/L)62日龄106.06108.84108.8095.5592.544.880.7565日龄92.68ab108.14a96.45ab75.88b75.52b3.860.0368日龄93.02ab108.76a93.10ab89.84b72.96c3.190.01LYS/(U/L)62日龄473.41437.21443.65498.95501.8318.630.0865日龄606.64a398.23b468.13b601.25a641.72a25.630.0168日龄476.03b435.53b457.46b489.71ab535.74a10.060.01GH/(μg/L)62日龄36.1933.0435.5639.5241.202.090.7765日龄40.0433.1539.8741.7042.792.850.1468日龄40.3233.0133.9533.4342.931.910.25Hpt/(mg/L)62日龄288.29311.25293.61286.09267.7712.930.8965日龄306.53b406.76a374.43ab295.11b287.92b14.720.0368日龄320.26ab370.19a340.53ab307.60b292.35b8.120.03注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。65日龄时（断奶当天），LK组断奶犊牛血清中LYS活性显著低于HK组（P0.05），Hpt含量显著高于HK组（P0.05）；与LK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清中TP含量、LYS活性显著升高（P0.05），BUN、Cort、Hpt含量显著降低（P0.05）；与HK组相比，LT组断奶犊牛血清BUN含量显著降低（P0.05），L组断奶犊牛血清LYS活性显著降低（P0.05）。68日龄时（断奶后3 d），与LK组相比，LT组断奶犊牛血清中TP含量、LYS活性显著升高（P0.05），T组、LT组断奶犊牛血清中Cort、Hpt含量显著降低（P0.05）；与HK组相比，LT组断奶犊牛血清中TP含量、LYS活性显著升高（P0.05），Cort含量显著降低（P0.05）。2.3低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛免疫性能的影响（见表4）由表4可知，62日龄时（断奶前3 d），与HK组相比，LK组断奶犊牛血清中IgM含量显著降低（P0.05）；与LK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清中IgM含量显著升高（P0.05）；与HK组相比，LT组断奶犊牛血清中IgM含量显著升高（P0.05），L组断奶犊牛血清中IgM含量显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.001.T004表4低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛免疫性能的影响项目HK组LK组L组T组LT组SEMP值IgA/(mg/L)62日龄35.2330.8530.8635.3739.151.850.6165日龄32.48a19.18b29.80ab34.11a41.96a2.240.0468日龄33.9828.4931.9334.3741.312.130.43IgM/(mg/L)62日龄197.21b174.65d183.75cd207.37ab217.79a2.560.0365日龄213.28b182.11d198.96cd213.76b215.47a2.870.0168日龄200.66c198.62d199.46cd214.29b220.42a1.890.01IgG/(mg/L)62日龄27.3724.7526.5929.8832.761.480.5165日龄25.7621.4823.2230.0832.251.670.2168日龄30.8524.4926.7831.9634.761.660.33IFN-γ/(ng/L)62日龄1 296.76b1 243.32b1 279.80b1 385.62ab1 557.68a35.900.0565日龄1 366.291 078.391 249.301 443.681 482.1331.160.2768日龄1 253.001 091.231 171.251 364.111 434.0053.420.15IL-1/(ng/L)62日龄129.30bc158.13a142.11ab125.79bc115.87c4.230.0165日龄129.98a138.22a131.68a96.82ab84.67b7.080.0468日龄135.52163.69141.84121.26120.887.020.29IL-2/(ng/L)62日龄1 272.561 236.841 225.991 335.381 343.0931.730.7065日龄1 147.01b851.77b1 129.42b1 162.26b1 556.18a65.710.0168日龄1 253.66b977.09b1 230.12b1 366.46ab1 691.27a71.000.02IL-6/(ng/L)62日龄69.0678.2172.2264.5161.393.280.5465日龄66.3681.5271.7063.8162.514.650.8868日龄74.3783.4382.2269.9468.545.180.87TNF-α/(ng/L)62日龄287.12330.45300.60285.23269.3517.540.9065日龄328.76387.29373.80287.25227.6121.180.1268日龄326.46ab361.71a357.57a255.16ab207.06b20.380.0465日龄时（断奶当天），与HK相比，LK组断奶犊牛血清中IgA、IgM含量显著降低（P0.05）；与LK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清IgA、IgM含量显著升高（P0.05）；与HK组相比，LT组断奶犊牛血清中IgM含量显著升高（P0.05），L组断奶犊牛血清中IgM含量显著降低（P0.05）。68日龄时（断奶后3 d），与HK相比，LK组断奶犊牛血清IgM含量显著降低（P0.05）；与LK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清IgM含量显著升高（P0.05）；与HK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清中IgM含量显著升高（P0.05）。62日龄时（断奶前3 d），与LK组相比，LT组IFN-γ含量显著升高（P0.05），T组、LT组IL-1含量显著降低（P0.05）。与HK组相比，LT组IFN-γ含量显著升高（P0.05）。LK组与HK组相比，IL-1含量显著升高（P0.05）。65日龄时（断奶当天），与LK组相比，LT组IL-1含量显著降低（P0.05），IL-2含量显著升高（P0.05）。与HK组相比，LT组IL-1含量显著降低（P0.05），IL-2含量显著升高（P0.05）。68日龄时（断奶后3 d），与LK组相比，LT组IL-2含量显著升高（P0.05），TNF-α含量显著降低（P0.05）。与HK组相比，LT组IL-2含量显著升高（P0.05）。2.4低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛抗氧化能力的影响（见表5）由表5可知，62日龄时（断奶前3 d），与HK相比，LK组断奶犊牛血清中SOD、CAT活性显著降低（P0.05）；与LK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清中SOD、CAT活性显著升高（P0.05）；与HK组相比，LT组断奶犊牛血清中SOD、CAT活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.001.T005表5低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛抗氧化能力的影响项目HK组LK组L组T组LT组SEMP值MDA/(mmol/L)62日龄5.927.387.205.615.590.370.3565日龄5.086.886.005.905.880.440.5468日龄6.637.407.026.265.930.500.51SOD/(U/mL)62日龄157.43bc136.29d145.71cd172.01ab177.81a3.550.0165日龄174.21c150.69d159.48d199.90b210.58a5.060.0168日龄150.10b134.77d146.61bc152.00b165.06a2.650.01CAT/(U/L)62日龄96.24c78.98d95.36c119.84b122.95a2.760.0165日龄109.05b83.94d92.20c109.23b116.62a2.640.0168日龄97.26c57.48e94.04d103.17b119.48a4.330.01T-AOC/(U/mL)62日龄7.015.106.987.307.530.400.3565日龄7.07ab4.08b8.17a8.39a8.47a0.450.0468日龄4.973.386.256.267.060.470.9965日龄时（断奶当天），与HK相比，LK组断奶犊牛血清中SOD、CAT活性显著降低（P0.05）；与LK组相比，T组、LT组断奶犊牛血清中SOD、CAT的活性及T-AOC显著升高（P0.05）；与HK组相比，LT组断奶犊牛血清中CAT、SOD活性显著升高（P0.05），L组断奶犊牛血清中SOD、CAT活性显著降低（P0.05）。68日龄时（断奶后3 d），与HK相比，LK组断奶犊牛血清中SOD、CAT活性显著降低（P0.05）；与LK组相比，L组、T组、LT组断奶犊牛血清中SOD、CAT活性显著升高（P0.05）；与HK组相比，T组断奶犊牛血清中CAT活性显著升高（P0.05），L组断奶犊牛血清中CAT活性显著降低（P0.05）。3讨论日粮中氨基酸不平衡会造成粗蛋白利用率降低，进而减缓动物的生长发育。Abe等[9]研究表明，当以玉米-豆粕为主要日粮时，Lys和Met是3月龄内断奶犊牛的第一和第二限制性氨基酸。因此，本试验在LK组、L组、T组、LT组日粮中添加了同等的Lys和Met，以满足第一、二限制性氨基酸的需要；L组、T组、LT组日粮中分别添加Leu、Trp、Leu+Trp，以研究不同开食料对断奶犊牛生长及血清指标的影响。3.1低蛋白质日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛生长性能的影响向白菊等[10]研究表明，在低蛋白质日粮中补充过瘤胃氨基酸能够提高牛的生长性能。但处在断奶期的犊牛，短期内将大幅度影响断奶期犊牛对干物质的采食量以及平均日增重，进而影响犊牛的生长发育[11]。本试验中，LK组犊牛72日龄重（断奶后1周）、平均日增重和平均日采食量均低于其他组。原因可能包括两方面：一方面是各组受到了不同程度断奶应激的影响；另一方面是由于日粮中CP降低水平较HK组低，且未补充氨基酸。研究表明，Leu可促进犊牛骨骼肌蛋白合成，提高犊牛平均日增重[12-13]。色氨酸可提高动物机体的免疫以及抗应激能力[14]。3.2低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛血清生化指标的影响本试验中，LT组断奶犊牛血清中TP含量显著高于LK组，BUN含量低于LK组。苏有健[15]在仔猪低蛋白质日粮中添加色氨酸，发现仔猪血清尿素氮比高蛋白组低16%。Cort由肾上腺皮质分泌，可促进组织中蛋白质和脂肪分解，增加氨基酸释放入血液。本试验中，LT组断奶犊牛血清Cort含量显著低于其他组，LK组Cort含量最高。原因可能包括两个方面：一方面可能是由于低蛋白质日粮中未补充氨基酸，无法满足犊牛对营养物质需求；另一方面是犊牛断奶刺激了肾上腺皮质分泌Cort，导致血清Cort浓度升高[16]，与高艳霞等[17]、EL-Sangary等[18]结果一致。Hpt是参与免疫反应的主要急性蛋白，是机体受到应激的一个主要评价指标[19]。本试验中，LT组断奶犊牛血清中Hpt含量减少，表明在低蛋白日粮中补充Leu和Trp减缓了犊牛体内因断奶产生的应激反应。LYS具有溶解细菌细胞、迅速清理黏膜，增强抗感染的能力。本试验中，LT组各时间段断奶犊牛血清LYS含量均高于其他组。原因一方面是由于断奶应激激发了犊牛非特异性免疫；另一方面是日粮中补充Trp可有效缓解动物应激[20]。本研究表明，在低蛋白日粮中补充Trp对断奶犊牛的应激具有一定的缓解作用。3.3低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛免疫性能的影响张文杰等[21]研究表明，Trp及其代谢物通过调节免疫球蛋白和淋巴细胞的生成，提高机体免疫力，具有调节动物免疫的功能。Emadi等[22]研究表明，肉鸡日粮中添加一定水平的Trp可明显提高免疫球蛋白含量，增强抗病力。本试验中，LT组断奶犊牛血清中Trp含量高于HK组、LK组和L组，与Emadi等[22]研究结果一致。炎症是一种机体对抗外界有害刺激或病原体的自然防御机制[23]。IL-1是一种炎症细胞因子，在癌症中表达量较高[24]。IL-2主要由T细胞分泌，能够促进T、B淋巴细胞和NK细胞的增殖，活化巨噬细胞，参与细胞免疫。TNF-α可促进炎症反应[25]。INF-γ主要由活化的T细胞和自然杀伤（NK）细胞产生，INF-γ具有很好的免疫调节作用[26]。本试验中，LT组断奶犊牛血清中INF-γ、IL-2含量最高，LK组最低。Yue等[27]研究发现，慢性应激导致IL-1和TNF-α等促炎细胞因子水平升高。王斌[28]在日粮中添加Trp对试验0~7 d小鼠肠道炎症的缓解作用和机制的研究发现，Trp抑制促炎性细胞因子TNF-α含量。3.4低蛋白日粮补充亮氨酸和色氨酸对断奶犊牛抗氧化能力的影响动物在断奶、分群及运输等外界应激下，会提高5-羟色胺分解为5-羟基吲哚乙酸的速度，产生应激反应。李萌萌等[29]发现，给小鼠灌胃Trp可缓解慢性应激带来的焦虑等应激反应。王栋等[30]发现，抗氧化能力较强的犊牛断奶期生长性能更好，断奶应激较低。本试验中，LT组断奶犊牛血清T-AOC以及SOD、CAT活性最高，LT组MDA含量最低，李萌萌等[29]研究一致。4结论综上所述，在低蛋白日粮中补充亮氨酸（1.15%）和色氨酸（0.26%）提高了断奶期犊牛的生长性能，增强了断奶犊牛免疫力及抗氧化能力，缓解了犊牛断奶应激。