蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）属芽孢杆菌属（Bacillus），是一种兼性厌氧产芽孢的革兰氏阳性菌，广泛存在于自然环境中，环境适应性强，能够耐受高温、紫外线等生长条件[1-2]。蜡样芽孢杆菌可分为致病性与非致病性，其中致病性蜡样芽孢杆菌是引发食源性肠道类疾病的主要病原微生物之一，会对人类和动物的健康构成威胁[3-4]。患者误食带有致病性蜡样芽孢杆菌的食物后会引发腹泻、呕吐等症状，严重者还会诱发一些严重的疾病[5-7]。但蜡样芽孢杆菌属于人类正常菌群之一，只有携带毒素基因的菌株才能引起食物中毒[8]。因此，筛选非致病性的蜡样芽孢杆菌具有较高的应用价值。研究发现，一些非致病性的蜡样芽孢杆菌可作为植物生防菌[9-10]。目前，关于益生菌作为饲料添加剂的研究较多，其中芽孢杆菌的应用较为广泛[11]。非致病性的蜡样芽孢杆菌作为饲料添加剂可提高动物的抗炎能力[12-13]，促进动物生长和营养吸收[14-16]。蜡样芽孢杆菌还能够产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶，从而在消化道中与内源酶共同发挥作用，提高饲料消化率[17-20]。本试验从浓香型白酒窖泥中筛选获得一株蜡样芽孢杆菌疑似株，进行16S rDNA分析、形态学鉴定、生理生化试验以及生长曲线测定等，利用响应面分析得到培养该菌的最佳培养基配方以及培养条件，为新型绿色微生物饲料的发展提供试验参考。1材料与方法1.1窖泥窖泥样品采自中国安徽文王酒业有限公司。1.2培养基强化梭菌培养基（reinforced Clostridial medium，RCM）：10.0 g蛋白胨、3.0 g酵母膏、5.0 g葡萄糖、10.0 g牛肉膏、1.0 g可溶性淀粉、0.5 g盐酸半胱氨酸、5.0 g氯化钠、3.0 g乙酸钠，溶于1 000 mL去离子水内，121 ℃高压灭菌20 min。固体培养基需要添加2%琼脂。1.3测定指标及方法1.3.1菌株筛选取窖泥3 g置于含有80%培养基的100 mL螺口瓶内，充分混匀，85 ℃水浴10 min，封口膜，隔绝氧气，放入厌氧袋中，35 ℃恒温培养箱静置培养10 d。观察螺口瓶内产气情况，选用产气多的螺口瓶吸取5 mL加入装有RCM培养基的螺口瓶内，重复上述步骤，富集培养4~5次。吸取富集培养菌液100 μL进行涂布，封口膜隔绝氧气，放入厌氧袋中，35 ℃恒温培养箱静置培养2 d。挑取单菌落三区划线重复此步骤2~3次，得到纯化单菌落。1.3.2革兰氏染色与生理生化鉴定分离纯化后的菌株进行革兰氏染色并参照《伯杰细菌鉴定手册》对疑似菌株进行相关生理生化鉴定。1.3.3分子生物学鉴定纯化后的菌株进行厌氧培养，35 ℃恒温培养箱静置培养2 d，吸取菌液1 μL进行PCR鉴定。选用细菌通用引物27F和1 492 R，使用PCR向16S rDNA的PCR产物末端加上带有Index的接头，以便进行NGS测序。PCR反应体系：2×Es Taq MasterMix 12.5 μL、27F 1 μL、1 492R 1 μL、菌株培养液1 μL，ddH2O补至总体系25 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min；94 °C变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30个循环；72 ℃终延伸2 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。1.3.4生长曲线测定将平板上的菌株接种到50 mL RCM培养基中，30 ℃、160 r/min摇瓶培养，测定种子液的OD600 nm值。1.3.5增值培养基优化1.3.5.1碳源优化以LB培养基为基础，选取葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖作为碳源，设置8.0 g/L为单一碳源的起始添加量，其他成分保持不变，培养基分装于容量250 mL的螺口试剂瓶内，接种量为10%，每组3个平行，30 ℃、160 r/min摇瓶培养，11 h取样，测定OD600 nm值，确定最佳碳源的种类。确定最佳碳源种类后，设置单一变量，将碳源的浓度分别设置为6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 g/L，接种量和培养条件保持不变，确定优化碳源的最佳浓度。1.3.5.2氮源优化以优化后碳源种类以及添加量的培养基为基础，选取牛肉膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨作为氮源，设置8.0 g/L为单一氮源的起始添加量，其他成分保持不变，接种量和培养条件同1.3.5.1，确定最佳氮源的种类。确定最佳氮源种类后，设置单一变量，将氮源浓度分别设置为6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 g/L，接种量和培养条件不变，确定优化氮源的最佳浓度。1.3.5.3金属离子优化以优化后碳源、氮源及其添加量的培养基为基础，选取Na+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、K+，设置0.15 g/L为单一金属离子起始浓度，其他成分均保持不变，接种量和培养条件同1.3.5.1，确定最佳金属离子的种类。确定最佳金属离子种类后，设置单一变量，最佳金属离子的浓度设置为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 g/L，接种量和培养条件不变，确定优化氮源的最佳浓度。1.3.6响应面优化试验1.3.6.1最陡爬坡试验在单因素试验的基础上，以蜡样芽孢杆菌OD值为响应值（Y），选取3个影响最大的因素葡萄糖、蛋白胨、Ca2+，采用Design-Expert 10.0.8软件进行Box-Behnken试验设计，确定培养基成分的最佳组合和最优值。最陡爬坡试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.T001表1最陡爬坡试验设计水平葡萄糖浓度蛋白胨浓度Ca2+浓度18100.3210120.5312140.7414160.9g/L1.3.6.2响应面试验因素水平设计（见表2）综合单因素、最陡爬坡试验结果，选择影响较大的3个因素作为响应面分析因素，设计响应面试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.T002表2响应面试验因素水平水平X1葡萄糖浓度X2蛋白胨浓度X3 Ca2+浓度18100.3210120.5312140.7g/L1.3.7培养条件优化在确定最优培养基的条件下，对转速、培养温度、接种量、pH值进行分析，确定最适培养条件。在0、80、160、270 r/min条件下30 ℃，接种量为10%，培养11 h，离心除菌体，确定菌株发酵时的最佳转速。在25、30、35、37、40 ℃条件下，160 r/min摇瓶培养11 h，离心除菌体，确定菌株的最佳发酵温度。设置接种量为1.5%、3.0%、4.5%、6.0%，30 ℃、160 r/min摇瓶培养11 h，离心除菌体，确定最佳接种量。调节初始pH值为5、6、7、8、9，30 ℃、160 r/min摇瓶培养11 h，离心除菌体。考虑酸性条件对霉菌生长具有一定的抑制作用，会对试验结果造成一定干扰。因此，发酵完成后调整发酵液的pH值为中性，后续操作均测定生物量OD600 nm值，确定最佳起始pH值。1.3.8优化后的蜡样芽孢杆菌生长曲线的绘制使用优化后的培养基，分装于250 mL螺口瓶内，取3%蜡样芽孢杆菌培养液30 ℃、160 r/min摇瓶培养，每隔12 h取样检测生物量OD600 nm并记录数值，绘制蜡样芽孢杆菌的生长曲线。2结果与分析2.1菌种分离培养及形态学鉴定结果（见图1）由图1（a）可知，分离后的菌落形态在RCM平板培养基上呈现菌落大，颜色为白色不透明，中间深四周浅，菌落中心微微凸起，表面粗糙，扁平，不规则。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F001图1菌落形态及革兰氏镜检结果（a）菌落形态 （b）革兰氏染色结果由图1（b）可知，该菌为革兰氏阳性菌，菌体呈现长棒状。2.2分离株生理生化鉴定结果（见表3）由表3可知，根据《伯杰氏系统细菌手册》可初步判断分离株为蜡样芽孢杆菌，命名为J-1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.T003表3分离株生理生化结果项目结果项目结果葡萄糖+明胶液化+果糖+0.01%溶菌酶+MR试验+精氨酸+V-P试验+硝酸盐还原+H2S试验-淀粉水解+柠檬酸盐-10%氯化钠-注：“+”表示阳性或可以利用，“-”表示阴性或不可以利用。2.3分子生物学鉴定结果（见图2）由图2可知，单菌PCR扩增产物在1 500~2 000 bp间均出现了清晰且无弥散的条带，表明得到了较高质量的PCR扩增产物。将扩增产物送样测序，之后将菌株16S rDNA全序列基因组在NCBI中的BLAST数据库进行比对。该菌株核酸序列的同源性大于99%，比对结果为蜡样芽孢杆菌（Bacillus Cereus）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F002图2PCR产物扩增结果注：M为Maker；1为菌株的16S rDNA PCR产物。2.4蜡状芽孢杆菌生长曲线测定结果（见图3）由图3可知，0~6 h为生长缓慢期，6~8 h为生长对数期，菌体含量多，8~14 h为平稳期，10 h菌体生物量OD600 nm最高为8.381 9。因此，后续试验选择10 h的发酵液进行测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F003图3蜡状芽孢杆菌生长曲线测定结果2.5培养基优化结果2.5.1碳源及最优碳源浓度对蜡样芽孢杆菌生长的影响（见图4）图4不同碳源及最优碳源浓度对蜡样芽孢杆菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F4a1（a）碳源对蜡样芽孢杆菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F4a2（b）葡萄糖添加量对蜡样芽孢杆菌生长的影响由图4（a）可知，葡萄糖、果糖、可溶性淀粉、麦芽糖、蔗糖均可以为蜡样芽孢杆菌生长提供营养物质，培养10 h，葡萄糖中蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm值最高为8.403 2，因此确定蜡样芽孢杆菌可利用的最佳碳源为葡萄糖。在蜡样芽孢杆菌的生长过程中，葡萄糖会为蜡样芽孢杆菌提供生长基本的营养物质。葡萄糖含量过低时提供的营养物质不足，蜡样芽孢杆菌生长受到限制，葡萄糖含量过高会导致培养基渗透压升高，蜡样芽孢杆菌水分渗出导致生长受到限制甚至死亡[19]。由图4（b）可知，葡萄糖浓度为10.0 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm达到最大值8.602 8，表明适合蜡样芽孢杆菌生长的最优碳源为葡萄糖，且适宜浓度为10.0 g/L。2.5.2氮源及最优氮源添加量对蜡样芽孢杆菌生长的影响（见图5）图5氮源及最优氮源浓度对蜡样芽孢杆菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F5a1（a）氮源对蜡样芽孢杆菌生长的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F5a2（b）蛋白胨添加量对蜡样芽孢杆菌生长的影响由图5（a）可知，牛肉膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、酵母膏、胰蛋白胨均对蜡样芽孢杆菌生长具有一定作用，其中蛋白胨效果最明显，在培养10 h的过程中，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm最高为8.652 8。因此，确定蜡样芽孢杆菌的可利用最佳氮源为蛋白胨。由图5（b）可知，蛋白胨浓度为12.0 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm达到最大值8.852 8。结果表明，适合蜡样芽孢杆菌生长的最优氮源为蛋白胨，最佳浓度为12.0 g/L。2.5.3金属离子及最优金属离子浓度对蜡样芽孢杆菌生长的影响（见图6）由图6（a）可知，Na+和Ca2+对蜡样芽孢杆菌生长有明显的促进作用，因此确定蜡样芽孢杆菌可利用的最佳金属离子为Na+和Ca2+。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F006图6金属离子及最优金属离子浓度对蜡样芽孢杆菌生长的影响（a）金属离子对蜡样芽孢杆菌生长的影响 （b）Na+对蜡样芽孢杆菌生长的影响 （c）Ca+对蜡样芽孢杆菌生长的影响由图6（b）可知，当Na+0.7 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量增加；当Na+为0.7 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm达到最大值8.932 8；当Na+0.7 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量减少。当Ca2+0.5 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量在增加；当Ca2+为0.5 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm达到最大值9.132 8；当Ca2+0.5 g/L时，蜡样芽孢杆菌的生物量减少。结果表明，本试验条件下，适合蜡样芽孢杆菌生长的最优金属离子为Na+和Ca2+，最佳添加量分别为0.7 g/L和0.5 g/L。2.6响应面试验优化结果2.6.1最陡爬坡试验结果（见表4）由表4可知，随着各物质添加水平增加，蜡样芽孢杆菌生物量增加，各物质添加水平在第2梯度时，蜡样芽孢杆菌生物量达到最大，梯度再提高，蜡样芽孢杆菌生物量下降。因此，选择第2梯度的浓度进行进一步的响应面优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.T004表4最陡爬坡试验结果水平葡萄糖浓度/(g/L)蛋白胨浓度/(g/L)Ca2+浓度/(g/L)蜡样芽孢杆菌OD600 nm值18100.38.418 3210120.58.582 9312140.78.461 6414160.98.382 92.6.2响应面优化及方差分析结果（见表5、表6）在最陡爬坡试验的基础上，利用Design Expert 10.0软件，葡萄糖（X1）、蛋白胨（X2）和Ca2+（X3）对蜡样芽孢杆菌生物量OD600 nm值（Y）的影响进行响应面试验，进一步确定培养基的最佳条件。通过Design Expert 10.0软件对表5数据进行多元线性回归分析，得到拟合试验因素的回归方程：Y=9.31+0.066X1+0.008X2+0.25X3-0.017X1X2-0.009X1X3+0.015X2X3-0.43X12-0.41X22-0.30X32。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.T005表5响应面试验结果试验号X1X2X3Y10009.278 120-118.788 130009.389 141108.483 951-108.493 060118.826 270-1-18.394 88-1018.751 1901-18.373 110-1108.482 211-1-108.424 912-10-18.182 7130009.329 2140009.276 31510-18.394 3161018.998 3170009.281 2由表6可知，该模型P0.000 1，失拟项不显著，且失拟项P0.05，该模型和试验拟合度较好。模型的决定系数R2为0.984 3，校正后的决定系数R2为0.964 1，变异系数（C.V.）为8.8%，表示该模型有8.8%的变异不能由该模型解释，说明试验操作和模型均可信。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.T006表6回归方程方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型2.630 090.290 048.790＜0.000 1X10.035 010.035 05.8300.532 5X20.000 510.000 50.0870.396 3X30.510 010.510 085.0500.244 1X1X20.001 010.001 00.1800.233 7X1X30.000 310.000 30.0530.806 4X2X30.000 910.000 90.1500.609 3X120.770 010.770 0128.0800.000 1X220.720 010.720 0119.8400.000 2X320.380 010.380 064.2400.297 7残差0.042 070.060 0失拟项0.032 030.011 04.4900.090 5纯误差0.010 040.002 0总离差2.670 016注：P0.05表示影响差异显著；P0.01表示影响极显著。2.6.3各因素交互作用对蜡样芽孢杆菌生物量的影响（见图7）由图7可知，葡萄糖、蛋白胨和Ca2+对蜡样芽孢杆菌生物量影响均不显著（P0.05），葡萄糖与蛋白胨、葡萄糖与Ca2+、蛋白胨与Ca2+交互作用对蜡样芽孢杆菌生物量影响均不显著（P0.05）。图7各因素交互作用对蜡样芽孢杆菌生物量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F7a1（a）葡萄糖和蛋白胨对蜡样芽孢杆菌生物量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F7a2（b）葡萄糖和Ca2+对蜡样芽孢杆菌生物量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F7a3（c）蛋白胨和Ca2+对蜡样芽孢杆菌生物量的影响2.6.4验证试验结果为验证Design-Expert 10.0软件所预测的最佳试验条件，在所提供的最佳发酵条件下，考虑现实操作条件，调整最佳发酵条件为蛋白胨12.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、NaCl 0.7 g/L、CaCl2 0.5 g/L、培养温度30 ℃，在此条件下进行3次平行试验，得到发酵液蜡样芽孢杆菌生物量为9.410 8，较模型预测值9.281 2高约1.014%，此差值在可接受范围内。2.7培养条件优化结果2.7.1转速对蜡样芽孢杆菌生长的影响（见图8）由图8可知，当转速低于160 r/min时，蜡样芽孢杆菌生物量随着转速增加而增加。这是因为转速提高了发酵培养基中的溶氧量，为菌体生命活动提供了充足的氧气。当转速高于160 r/min时，蜡样芽孢杆菌生物量降低，可能是由于过高的转速影响了菌体的正常生长及生命活动，从而导致发酵液中菌体浓度逐渐减少。因此，发酵时选用的转速为160 r/min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F008图8转速对蜡样芽孢杆菌生长的影响2.7.2培养温度对蜡样芽孢杆菌生长的影响（见图9）由图9可知，在10 h的培养中，在30 ℃的培养环境下，蜡样芽孢杆菌生长速度最快，且生物量OD600 nm最高，可达9.219 2。因此，确定蜡样芽孢杆菌的最适培养温度为30 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F009图9培养温度对蜡样芽孢杆菌生长的影响2.7.3接种量对蜡样芽孢杆菌生长的影响（见图10）由图10可知，当接种量小于3.0%时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm随接种量的升高而增加，接种量为3%时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm达到最大，当接种量大于3.0%时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm随接种量的升高而减少。因此，接种量选择3%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F010图10接种量对蜡样芽孢杆菌生长的影响2.7.4pH值对蜡样芽孢杆菌生长的影响（见图11）由图11可知，当pH值小于7时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm随pH值的升高而增加；pH值为7时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm达到最大；当pH值大于7时，蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm随pH值的升高而减少。因此，蜡样芽孢杆菌适宜在中性环境下生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F011图11pH值对蜡样芽孢杆菌生长的影响2.8优化后的蜡样芽孢杆菌生长曲线（见图12）由图12可知，蜡样芽孢杆菌在最优条件下，仅在8 h达到对数生长期，8 h时达到菌体生物量OD600 nm最高为9.671 8。蜡样芽孢杆菌的生物量OD600 nm最后稳定在8.800 0左右，主要是因为培养基过少，菌体浓度过高，营养物质消耗过快导致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.016.F012图12优化后的蜡样芽孢杆菌生长曲线3结论本试验结果显示，蜡样芽孢杆菌疑似菌株为蜡样芽孢杆菌，命名为J-1。试验对J-1的增值培养基及培养条件进行单因素分析，采用响应面分析的方法得到最优培养基及培养条件，优化后培养基中最佳碳源为葡萄糖10.0 g/L，最佳氮源为酵母膏12.0 g/L，最佳金属离子为Ca2+ 0.5 g/L，转速为160 r/min，最适培养温度为30 ℃，最佳接种量为3.0%，最适pH值为7。此时，蜡样芽孢杆菌最大OD600 nm值达到9.671 8，比优化前提高约1.72%。