益生菌可以提高免疫细胞因子的表达，降低炎性因子的表达，提高肠道免疫力。益生菌能够刺激肉仔鸡肠道免疫组织的快速发育，提高免疫细胞活性，增强肉仔鸡的免疫功能[1]。益生菌的细胞壁中含有调节免疫因子，免疫调节因子能够调节转录因子，使机体产生抗炎作用，抑制炎症发生[2]。酸化剂在畜禽养殖生产过程中应用较广泛。在日粮中添加适量的酸化剂可以明显降低肉鸡胃肠道内的pH值。适当的酸性环境有利于机体对日粮的消化吸收，从而进一步提高饲料的消化率[3]。酸化剂进入家禽机体内后，能够直接参与机体的营养物质代谢，其中柠檬酸可以直接进入三羧酸循环的代谢过程[4]。酶是由活细胞产生的生物大分子类蛋白质，是重要的生物催化剂。酶制剂含单一酶或混合酶，具有促进营养物质消化的作用，可以提升肉鸡对日粮消化吸收，从而提高肉鸡的生长性能[5]。目前，在日粮中单独添加益生菌、酸化剂和酶制剂的研究较多。但将3种添加剂联合在动物日粮中的研究较少。因此，本试验探讨益生菌、酸化剂、酶制剂联合使用对大骨鸡免疫功能的影响，为其在家禽养殖中的应用开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料益生菌（活菌数量≥5.0×109 CFU/g）和酸化剂均由广州广牧丰生物技术有限公司提供。益生菌包括乳酸杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等。酸化剂包括富马酸（≥350 g/kg）、乳酸（≥150 g/kg）、柠檬酸（≥70%）等。复合酶（木聚糖酶活力≥10 000 U/g、酸性蛋白酶活力≥3 000 U/g、中性蛋白酶活力≥3 000 U/g、淀粉酶活力≥500 000 U/g）由广东溢多利生物科技股份有限公司提供。1.2试验设计选取1日龄健康、体重相近的大骨鸡1 200只，随机分为5组，A组（对照组）大骨鸡饲喂基础日粮；B组大骨鸡饲喂基础日粮+0.3%益生菌；C组大骨鸡饲喂基础日粮+0.3%益生菌+0.2%酸化剂；D组大骨鸡饲喂基础日粮+0.3%益生菌+100 g/t酶制剂；E组大骨鸡饲喂基础日粮+0.3%益生菌+0.2%酸化剂+100 g/t酶制剂，每组4个重复，每个重复60只鸡。试验期63 d。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T001表1基础日粮组成及营养水平项目1~4 w5~9 w原料组成/%玉米58.0067.00豆粕27.0018.00膨化大豆10.0010.00石粉1.001.00预混料4.004.00合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)11.8712.17粗蛋白质/%21.0217.09钙/%1.020.86总磷/%0.550.48有效磷/%0.310.26赖氨酸/%1.120.82蛋氨酸+半胱氨酸/%0.830.72注：1.预混料购自正大预混料有限公司。2.营养水平均为计算值。1.3饲养管理大骨鸡在育雏舍饲养42 d，转入育成舍，育成笼为3层全阶梯式，每5只大骨鸡在1个笼中饲养。鸡舍采用自然光照，以人工光照补充，自然通风。大骨鸡自由采食、饮水，每日饲喂3次，每日观察大骨鸡健康状况，掌握大骨鸡的采食和饮水情况、行为表现、粪便状态等，卫生消毒及免疫程序均按照大骨鸡生产的相关规定进行。1.4测定指标及方法1.4.1免疫器官指数大骨鸡饲养至28、63 d时，每组随机选取5只大骨鸡，用于测定免疫器官指数。将大骨鸡放血后，取出大骨鸡脾脏、胸腺、法氏囊，称重，记录，计算大骨鸡免疫器官指数。免疫器官指数=器官重/鸡体重(1)1.4.2抗体水平试验第7、14、28 d时，各组随机选取5只大骨鸡，翅静脉采血2 mL，分离血清，测定新城疫病毒抗体效价和H9亚型禽流感病毒抗体效价。1.4.3外周血免疫球蛋白含量试验第1、14、28、42、56 d时，每个重复随机选取5只大骨鸡，用灭菌注射器采出2~4 mL大骨鸡心脏血液，室温静置2 h，分离血清，-20 ℃保藏。采用间接酶联免疫吸附试验测定大骨鸡外周血免疫球蛋白含量。1.4.4大骨鸡外周血T、B淋巴细胞数量试验第1、28、63 d，采用免疫SPA菌体花环法测定大骨鸡的外周血T、B淋巴细胞数量。1.5数据统计与分析采用Excel软件对试验数据进行统计，SPSS 18.0软件进行分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡免疫器官指数的影响（见表2）由表2可知，28 d时，C组、D组、E组大骨鸡脾脏指数和法氏囊指数均显著高于对照组（P0.05）。63 d时，B组、C组、D组、E组大骨鸡脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数均显著高于对照组（P0.05）。28 d时，各组大骨鸡胸腺指数差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T002表2益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡免疫器官指数的影响组别28 d63 d脾脏指数胸腺指数法氏囊指数脾脏指数胸腺指数法氏囊指数A组4.36±0.23b6.13±0.383.73±0.20b2.31±0.10b3.31±0.23b1.81±0.07bB组4.66±0.25ab6.46±0.393.95±0.18ab2.62±0.11a3.90±0.24a2.15±0.07aC组4.74±0.25a6.56±0.394.09±0.18a2.65±0.08a3.94±0.17a2.17±0.08aD组4.74±0.25a6.56±0.374.07±0.20a2.64±0.07a3.95±0.23a2.19±0.07aE组4.75±0.23a6.55±0.384.06±0.19a2.65±0.10a3.95±0.23a2.23±0.06a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表4、表6、表7与此同。g/kg2.2益生菌与酸化剂、酶制剂对大骨鸡抗体水平的影响（见表3、表4）由表3可知，14、28 d时，与对照组相比，B组、C组、D组、E组大骨鸡新城疫抗体水平均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T003表3益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡新城疫抗体水平的影响组别7 d14 d28 dA组4.26±0.426.42±0.71b7.78±0.86bB组4.30±0.387.53±0.71a9.03±0.85aC组4.32±0.447.59±0.72a9.16±0.87aD组4.30±0.397.71±0.71a9.21±0.77aE组4.27±0.427.83±0.68a9.30±0.73alog2由表4可知，14、28 d，与对照组相比，B组、C组、D组、E组大骨鸡禽流感抗体水平均显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T004表4益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡禽流感抗体水平的影响组别7 d14 d28 dA组3.34±0.385.74±0.73b6.75±0.90bB组3.32±0.316.87±0.70a8.20±1.01aC组3.39±0.446.89±0.75a8.26±0.86aD组3.31±0.287.01±0.76a8.35±0.89aE组3.31±0.307.14±0.70a8.68±1.06alog22.3益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡外周血免疫球蛋白含量的影响（见表5）由表5可知，14、28 d时，B组、C组、D组、E组大骨鸡外周血IgA、IgG、IgM含量均显著高于对照组（P0.05）。42 d时，C组、D组、E组大骨鸡外周血IgA含量均显著高于对照组（P0.05），IgM含量均显著高于B组和对照组（P0.05），E组IgM含量显著高于C组（P0.05），B组IgA含量显著低于E组（P0.05）。56 d时，E组大骨鸡外周血IgA含量显著高于对照组（P0.05），C组、D组、E组大骨鸡外周血IgM含量显著高于B组和对照组（P0.05），C组、D组大骨鸡外周血IgM含量显著低于E组（P0.05）。42、56 d时，C组、D组、E组大骨鸡IgG含量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T005表5益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡外周血免疫球蛋白含量的影响项目A组B组C组D组E组IgA1 d0.71±0.030.72±0.030.74±0.030.73±0.030.71±0.0314 d1.36±0.03b1.39±0.03a1.40±0.02a1.39±0.02a1.41±0.02a28 d1.28±0.03b1.32±0.03a1.35±0.02a1.33±0.02a1.36±0.03a42 d1.20±0.03c1.23±0.03bc1.25±0.02ab1.26±0.02ab1.27±0.02a56 d1.16±0.02b1.17±0.03ab1.19±0.03ab1.18±0.02ab1.20±0.03a续表5　益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡外周血免疫球蛋白含量的影响lg（1/T）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T006项目A组B组C组D组E组IgG1 d1.37±0.071.38±0.061.38±0.061.36±0.071.38±0.0714 d1.56±0.02b1.61±0.03a1.62±0.03a1.62±0.03a1.64±0.03a28 d1.31±0.02b1.36±0.03a1.37±0.03a1.36±0.02a1.38±0.03a42 d1.28±0.03b1.31±0.03ab1.33±0.02a1.33±0.01a1.34±0.02a56 d1.27±0.02b1.30±0.03ab1.32±0.03a1.31±0.02a1.33±0.02aIgM1 d0.75±0.030.76±0.030.77±0.030.75±0.030.76±0.0314 d1.31±0.04b1.38±0.04a1.40±0.04a1.39±0.04a1.42±0.04a28 d1.23±0.04b1.29±0.04a1.30±0.04a1.30±0.04a1.31±0.04a42 d1.12±0.02c1.14±0.02c1.18±0.02b1.19±0.02ab1.21±0.02a56 d1.08±0.01d1.10±0.01cd1.14±0.02b1.14±0.01b1.17±0.02a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；2.4益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡外周血T、B淋巴细胞数量的影响（见表6、表7）由表6、表7可知，28、63 d时，B组、C组、D组、E组大骨鸡外周血T、B淋巴细胞数量均显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T007表6益生菌与酸化剂、酶制剂对大骨鸡外周血T淋巴细胞数量的影响组别1 d28 d63 dA组22.64±0.6636.25±0.89b42.07±1.05bB组22.76±0.5838.33±0.93a44.17±1.03aC组22.82±0.6438.86±0.89a44.40±1.03aD组22.54±0.6339.08±0.94a44.49±1.03aE组22.93±0.6139.68±0.90a44.83±1.02a个10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.009.T008表7益生菌与酸化剂、酶制剂对大骨鸡外周血B淋巴细胞数量的影响组别1 d28 d63 dA组16.21±0.2428.65±0.63b22.51±0.71bB组16.19±0.2231.78±0.71a24.74±0.76aC组16.36±0.2232.17±0.76a25.05±0.79aD组16.20±0.2032.20±0.77a25.07±0.78aE组16.38±0.2232.77±0.66a25.62±0.71a个3讨论3.1益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡免疫器官功能的影响免疫器官生长发育与动物的免疫功能密切相关。免疫器官生长良好，说明机体的免疫功能较强，机体的细胞免疫和体液免疫得到提高[6]。胸腺是家禽的重要淋巴器官。胸腺功能与免疫紧密相关。T淋巴细胞与整个淋巴器官的发育和免疫力密切关联。胸腺是T淋巴细胞的形成、分化、发育、成熟的场所[7]。法氏囊是家禽中枢免疫器官，是B淋巴细胞发育场所[8]。家禽的外周免疫器官包括壁旁淋巴细胞、肠道淋巴组织、脾脏等。脾脏是家禽体内最大的外周免疫器官。脾脏的主要功能是参与机体的免疫应答，能够产生特异性的免疫反应，对抗病原微生物，保护家禽健康[9]。评价家禽免疫效能可以用家禽的免疫器官指数作为参考[10-11]。本研究发现，在大骨鸡的饲粮中添加益生菌与酸化剂、酶制剂，可以显著提高大骨鸡脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数，表明益生菌与酸化剂、酶制剂联合使用能够促进大骨鸡免疫器官发育，提高机体免疫水平，使大骨鸡对外界刺激的抵抗能力提高。有研究表明，益生菌对提高大型肉鸡的免疫器官指数具有显著作用，肉鸡血清中IgG的水平明显提升[12]。Jin等[13]研究发现，益生菌具有促进肉鸡脾脏发育的作用。3.2益生菌、酸化剂、酶制剂对大骨鸡外周血免疫功能的影响家禽注射新城疫疫苗后，免疫系统受到刺激，会产生新城疫的抗体，保护家禽健康。对新城疫抗体进行检测，可以掌握疫苗对家禽的保护程度，也为下一次疫苗注射时间提供参考[14]。本研究表明，在大骨鸡饲粮中添加益生菌、酸化剂、酶制剂，大骨鸡新城疫抗体水平和禽流感抗体水平均显著提高，表明益生菌与酸化剂、酶制剂能够相互协同，相互促进，提高机体免疫力。益生菌可刺激B细胞增殖，使机体的抗体滴度维持在一个较高的水平[15]。当机体受到应激刺激时，酮酸和短链有机酸等能够迅速释放能量，应对外界的应激刺激，降低对机体的损伤程度，明显提高机体的抵抗力[16]。酶制剂可以使某些毒性物质如内毒素等丧失活力，保护肝脏免受损害，酶制剂还具有提高肝脏的解毒能力的作用[17]。当益生菌进入家禽机体后，会被机体当作一种抗原物质，从而激活机体内的T淋巴细胞和B淋巴细胞。机体内的巨噬细胞在益生菌的作用下发挥抗原呈递效应，刺激家禽免疫系统产生相应的抗体，增强机体的免疫功能[18]。免疫球蛋白抑制或杀灭入侵机体的致病菌。Sekar等[19]研究发现，T淋巴细胞的数量变化可以判断机体细胞免疫机能的状态，也可以推断出家禽机体免疫水平，本试验中，42、63 d时，大骨鸡外周血IgA、IgG和IgM含量显著高于对照组；与对照组相比，大骨鸡外周血T、B淋巴细胞的数量均显著增加。本研究表明，在饲粮中添加益生菌与酸化剂、酶制剂可显著提高大骨鸡免疫水平；益生菌与酸化剂、酶制剂两者或三者联合使用均优于单独使用，三者联合使用效果更明显。Tana等[20]研究发现，益生菌可提高肉鸡血清中IgG、IgA含量。赵莉等[21]研究发现，饲粮中添加酶联微生态制剂、酸化剂可提高血清中IgG、IgA、IgM含量。范秋丽等[22]研究发现，益生菌、酸化剂与复合酶能够显著提高肉鸡血浆中IgG、IgM含量。4结论本研究表明，在饲粮中添加益生菌与酸化剂、酶制剂可以提高大骨鸡脾脏指数、胸腺指数和法氏囊指数，增加外周血T淋巴细胞数量，增强大骨鸡新城疫抗体及禽流感抗体水平，提高外周血IgA、IgG、IgM含量，提高外周血B淋巴细胞数量。益生菌与酸化剂、酶制剂联合使用可增强大骨鸡体液免疫功能。