大肠杆菌和沙门氏菌会影响动物机体健康[1]。抗生素会导致大肠杆菌和沙门氏菌的耐药性增强[2]。因此，寻找天然的抗菌药物治疗细菌性感染成为研究热点。植物精油是植物体内的次级代谢物，具有抑菌、抗氧化、抗癌等功能[3-4]。肉桂多个部位均可入药，功效也各不相同。我国肉桂的主要产地为广西、广东和云南等，产量约占全国的95%[5]。现代药理学研究发现，肉桂具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗菌、抗病毒等功效，被广泛应用于食品、香料和医药等领域[6-7]。八角茴香是我国特有的香辛料和中药材，主要分布于广西、广东、贵州和云南等地[8]。八角茴香含有丰富的挥发油，成分复杂，常应用于中医药、食品加工、香料等领域[9]。现代药理学研究表明，八角茴香具有抗菌、抗氧化、杀虫、止痛、抗焦虑、镇静等功效[10]。目前，肉桂油和八角茴香油体内外抗菌作用研究较少。因此，本试验拟从单药药敏、联合药敏、体内大肠杆菌感染小鼠保护作用进行研究，考察肉桂油和八角茴香油的抗菌作用，旨为肉桂油和八角茴香油在饲料中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料与试验试剂大肠杆菌20株、沙门氏菌12株。质控菌为大肠杆菌ATCC25922，购自中国药品生物制品检定所。肉桂油、八角茴香油、八桂素（肉桂油、八角茴香油的复方制剂），均由广西八桂天香实业集团有限公司提供。营养肉汤（批号：190129，成分为蛋白胨、牛肉粉、氯化钠、葡萄糖）购自北京陆桥技术股份有限公司，LB琼脂（批号：190129，成分为胰蛋白胨、酵母粉、氯化钠、琼脂）购自北京陆桥技术股份有限公司，麦康凯琼脂（批号：20190315，成分为明胶胰酶水解物、胨、脱氧胆酸钠、中性红、乳糖、氯化钠、结晶紫、琼脂）购自北京博奥拓达科技有限公司，HE琼脂（批号：20191212，成分为蛋白胨、酵母浸粉、三号胆盐、乳糖、蔗糖、水杨苷、氯化钠、溴麝香草芬兰、硫代硫酸钠、柠檬酸铁铵、酸性品红、琼脂）购自青岛海博生物技术有限公司。1.2试验仪器Spx智能型恒温生化培养箱（宁波江南仪器厂），超净台工作台（苏州安泰空气技术有限公司），SHKE6000-8CE摇床（海尔生物医疗有限公司），CD-UPT-Ⅱ-20L纯水仪（成都越纯科技有限公司），ZEALWAYGR110DR高压灭菌蒸汽锅（广州安邦生物科技有限公司）。1.3测定指标及方法1.3.1单精油抑菌试验挑取沙门氏菌单菌落于8 mL营养肉汤中，37 ℃、180 r/min培养6 h，至对数生长期。取对数生长期沙门氏菌，用营养肉汤稀释至2×106 CFU/mL。采用微量稀释法测定肉桂油、八角茴香油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC。将八角茴香油配制为800 mg/L的储备液，取10个1.5 mL的EP管，每管加入500 μL营养肉汤；第1管加入500 μL的药物储备液，使其终浓度为400 mg/L；从第1管中取500 μL到第2管，使其终浓度为200 mg/L；依次重复操作至第10管，使其终浓度为0.78 mg/L。在96孔板中第1排加入100 μL不同浓度的药液，药液的终浓度为200、100、50至0.39 mg/L。1.3.2不同浓度肉桂油、八角茴香油单用及联用对大肠杆菌和沙门氏菌生长曲线的影响参照王振等[11]方法进行抑菌生长曲线的试验。1.3.3肉桂油、八角茴香油联合抑菌试验采用棋盘法[12]进行肉桂油和八角茴香油对大肠杆菌和沙门氏菌的联合药敏试验。抑菌浓度指数（FIC）即为分级抑菌浓度指数，为抗菌药药效学参数之一。FIC指数计算公式：FIC指数=甲药联用时的MIC甲药单用时的MIC+乙药联用时的MIC乙药单用时的MIC （1）FIC指数≤0.5为两者协同作用；0.5＜FIC指数≤1.0为两者相加作用；1.0＜FIC指数≤2.0为两者无关作用；FIC指数＞2.0为两者拮抗作用。1.3.4不同浓度八桂素对大肠杆菌感染小鼠的保护试验SPF级BALB/C小鼠，雄性，5周龄，体重（20±2）g。小鼠饲喂标准饲粮，自由采食饮水。温度（22±1） ℃、湿度（40±5）%。小鼠适应性饲养7 d。小鼠适应性饲养7 d后，随机分为5组，分别为空白对照组、模型组、高剂量组（20%）、中剂量组（10%）、低剂量组（5%），每组10只小鼠。试验期间小鼠每2 d饮水。将高剂量组（20%）、中剂量组（10%）、低剂量组（5%）八桂素混入小鼠饲粮中，小鼠自由采食。14 d后除空白对照组注射生理盐水外，其余各组均注射0.2 mL 109 CFU/mL的大肠杆菌。注射大肠杆菌2 d后，收集小鼠血液，离心，-20 ℃冻藏。解剖小鼠，称量肝脏、肾脏和脾脏重量，计算脏器指数。取小鼠十二指肠制作切片，进行H&E染色，观察病理情况。1.4数据统计与分析采用Excel软件对数据进行统计，Graphpad prism软件进行方差分析和制图，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值表示。2结果与分析2.1抑菌试验结果2.1.1肉桂油单用、八角茴香油单用及联用对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC结果（见表1）由表1可知，肉桂油和八角茴香油联合对大肠杆菌、沙门氏菌的抑制呈协同或相加作用；联用后肉桂油的MIC降为单药的1/4~1/2，八角茴香油的MIC降为单药的1/2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.T001表1肉桂油、八角茴香油单用及联用对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC结果项目肉桂油联用肉桂油八角茴香油联用八角茴香油大肠杆菌0.31~0.620.08~0.3150~10025~50沙门氏菌0.19~0.390.10~0.2050~10025~50mg/L2.1.2肉桂油、八角茴香油联合药敏试验结果（见表2）由表2可知，32株受试菌株的联合药敏感试验中，71.8%（23/32）的受试菌对肉桂油和八角茴香油联用呈相加作用；28.2%（9/32）的受试菌呈协同作用，两药联用未见无关和拮抗作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.T002表2肉桂油、八角茴香油联合药敏试验结果项目FIC值协同作用相加作用无关作用拮抗作用合计23900大肠杆菌0.16~0.5311900沙门氏菌0.16~0.28120002.1.3不同浓度的肉桂油对大肠杆菌和沙门氏菌生长曲线的影响（见图1）由图1可知，大肠杆菌和沙门氏菌在8、10 h浓度均达到109 CFU/mL。肉桂油以2 MIC、1 MIC、1/2 MIC浓度作用于大肠杆菌和沙门氏菌，大肠杆菌和沙门氏菌浓度未到达109 CFU/mL。研究表明，肉桂油对大肠杆菌和沙门氏菌的生长具有较强的抑制作用，且呈剂量依赖性。图1不同浓度肉桂油对大肠杆菌和沙门氏菌生长曲线的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F1a1(a)大肠杆菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F1a2(b)沙门氏菌2.1.4不同浓度八角茴香油对大肠杆菌和沙门氏菌生长曲线的影响（见图2）由图2可知，八角茴香油对大肠杆菌和沙门氏菌的生长具有较强的抑制作用。图2不同浓度八角茴香油对大肠杆菌和沙门氏菌生长曲线的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F2a1(a)大肠杆菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F2a2(b)沙门氏菌2.1.5肉桂油、八角茴香油联用对大肠杆菌和沙门氏菌生长曲线的影响（见图3）由图3可知，不同浓度肉桂油和八角茴香油联用，均表现为抑制大肠杆菌和沙门氏生长；在同等抑菌情况下，肉桂油和八角茴香油联用的药量均为单药的1/2。图3肉桂油、八角茴香油联用对大肠杆菌和沙门氏菌生长曲线的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F3a1(a)大肠杆菌10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F3a2(b)沙门氏菌2.2八桂素对大肠杆菌小鼠肠炎的保护作用2.2.1小鼠体重、饮食和饮水变化（见图4）由图4可知，小鼠第14 d注入大肠杆菌后，除空白小鼠体重、饮食及饮水量均未下降，其余各组均有下降；高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠下降趋势显著低于模型组。研究表明，八桂素可以降低由大肠杆菌导致的小鼠体重、饮食和饮水量下降，且呈剂量依赖性。(c)饮水变化图4　小鼠体重、饮食和饮水变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F4a1(a)体重变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F4a2(b)饮食变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F4a32.2.2小鼠脏器指数结果（见图5）由图5可知，模型组小鼠肝脏指数、脾脏指数和肾脏指数均高于空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。研究表明，八桂素可以缓解由大肠杆菌引起的小鼠脏器指数增加，且呈剂量依赖性。图5小鼠脏器指数结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F5a1(a)肝脏指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F5a2(b)脾脏指数10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F5a3(c)肾脏指数2.2.3小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量变化（见图6）由图6可知，模型组的小鼠血清中的TNF-α和IL-1β含量显著高于空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。图6小鼠血清中TNF-α和IL-1β含量变化10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F6a1（a）TNF-α10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F6a2(b)IL-1β研究表明，八桂素可以降低由大肠杆菌导致的小鼠血清中促炎因子的增加，且呈剂量依赖性。2.2.4小鼠十二指肠H&E切片结果（见图7）由图7可知，与空白组相比，模型组小鼠十二指肠肠绒毛数量显著减少，表现十二指肠肠腔变大的病理现象。高剂量组、中剂量组、低剂量组小鼠十二指肠病理现象明显缓解，且呈剂量依赖性。图7小鼠十二指肠H&E切片结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F7a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F7a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F7a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F7a410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.012.F7a53讨论肉桂和八角茴香具有良好的抗炎、抗氧化、抗焦虑和抗病毒作用[13-17]。肉桂油和八角茴香油具有一定的抑菌作用[18-19]。本研究中，肉桂油、八角茴香油单用及联用均对大肠杆菌和沙门氏菌具有一定的抑制作用，其中肉桂油的抑菌作用较强。肉桂油对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC为0.19~0.62 mg/L，八角茴香油对大肠杆菌和沙门氏菌MIC为50~100 mg/L。有研究表明，肉桂油和八角茴香油对供试酵母和细菌MIC分别为31.25、125.0 mg/L，对其他真菌及细菌均具有一定的抑制作用[20]。肉桂油对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌表现出广谱的抗菌活性[21]。本试验中，肉桂油对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用效果优于上述研究中的肉桂油对细菌的抑制作用。有研究表明，肉桂、蓝桉和迷迭香组合对14株革兰氏阳性菌、阴性菌、H1N1、HSV1病毒均有抑制作用[22]。肉桂油、山苍子精油和生姜精油组合抑制肠道主要致病菌的生长和繁殖[23]。本试验中，肉桂油和八角茴香油联合使用呈现协同作用，使单药的MIC降低至原来的1/4~1/2。本研究表明，肉桂油和八角茴香油联合使用对细菌生长的抑制作用加强。肉桂油有效地抑制大肠杆菌的生长，呈明显剂量依赖性。本试验中，模型组小鼠血清中促炎因子TNF-α和IL-1β含量显著高于空白组、高剂量组、中剂量组、低剂量组，表明八桂素（肉桂油、八角茴香油的复方制剂）具有一定的抗炎作用，与马克龙等[24]研究结果一致。脏器指数结果显示，八桂素显著降低了由大肠杆菌感染引起的小鼠肝脏、脾脏和肾脏指数的增加，缓解了小鼠体重的下降，减轻了小鼠的腹泻及脏器的充血程度。十二指肠的病理图片表明，八桂素对大肠杆菌引起的小鼠肠绒毛脱落、破损及十二指肠肠腔变大的病理现象具有一定的缓解作用。4结论本研究表明，肉桂油和八角茴香油单用及联用对大肠杆菌、沙门氏菌均具有不同程度的抑制作用。体内试验表明，肉桂油和八角茴香油单用及联用均对大肠杆菌感染的小鼠具有一定的预防作用。