宿主细胞和肠道微生物存在动态联系。研究表明，肠道微生物通过增强机体免疫屏障功能，促进上皮细胞增殖[1-2]。肠道菌群失衡可能会导致机体肠道炎症[3-4]。在高温应激条件下，鸡肠道微生物发生改变，造成鸡肠道菌群失衡，从而增强鸡肠道对病原菌的敏感度[5]。在饲粮中加入氧化油脂会增加宿主的氧化应激状态，影响宿主肠道健康，引起肠道氧化还原损伤[6]。本课题组前期研究发现，饲喂氧化大豆油能够降低肉鸡肠道抗氧化能力[7]。葛根为豆科植物粉葛的干燥根，属药、食同源植物，其主要活性成分为葛根素（Puerarin）[8]。葛根素具有清除自由基、抑制脂质过氧化、抗氧化、抗炎等功能[9-10]。有研究表明，饲喂葛根素能够显著降低小鼠肠道微生物活度[11]。饲粮中添加葛根素可缓解氧化大豆油引起的肉鸡肠道氧化损伤[7]。但葛根素对氧化大豆油引起肉鸡肠道氧化应激的研究较少。因此，本试验拟通过高通量测序检测肉鸡不同处理组回肠菌群结构和数量，探讨葛根素对饲喂氧化大豆油肉鸡肠道微生物的影响，为葛根素在肉鸡中的生产应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料葛根素（纯度：98.31%、批次号：CY19032）购自杨凌慈缘生物科技有限公司。氧化大豆油参考Liang等[12]方法制备。新鲜大豆油为市售精炼一级食用大豆油。新鲜大豆油在沸水浴中连续加热10 h，持续通入空气。参照GB/T 5538—2005测定大豆油过氧化值（POV），参照GB 5009.181—2016测定丙二醛（MDA）含量。加热大豆油，第4、7、9、10 h测定大豆油POV、MDA含量。当氧化大豆油POV≥90 meq/kg，停止加热，制备完成。试验所用新鲜大豆油POV为1.53 meq/kg、MDA含量为0.18 mg/kg，氧化大豆油POV为（95±2）meq/kg，MDA为26.41 mg/kg。1.2试验设计选取360只1日龄健康雌性黄羽肉鸡，随机分为4组，分别在新鲜大豆油组（A组）、新鲜大豆油+葛根素（750 mg/kg）组（B组）、氧化大豆油组（C组）、氧化大豆油+葛根素（750 mg/kg）组（D组），每组6个重复，每个重复15只肉鸡。试验期56 d。1~28日龄肉鸡大豆油或氧化大豆油添加量为2%，29~56日龄肉鸡大豆油或氧化大豆油添加量为3%。B组和D组在饲粮中额外添加相应剂量的葛根素。参考NT/T 33—2004配制肉鸡饲粮。饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.T001表1饲粮组成及营养水平原料组成/%1~28日龄29~56日龄营养水平1~28日龄29~56日龄合计100.00100.00玉米61.0064.00代谢能/(MJ/kg)12.3312.67麦麸2.503.00粗蛋白/%20.3818.63豆粕28.5025.00赖氨酸/%1.110.97鱼粉2.501.60蛋氨酸/%0.450.42大豆油/氧化大豆油2.003.00钙/%1.050.92食盐0.300.30有效磷/%0.490.43石粉1.301.20磷酸氢钙1.281.28DL-蛋氨酸0.120.12预混料0.500.50注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA 3 250 IU、VD3 1 010 IU、VE 75 mg、VK 3 mg、VB1 1 mg、VB2 2.5 mg、VB6 1.2 mg、VB12 0.009 mg、烟酸10 mg、D-泛酸钙5 mg、生物素0.04 mg、叶酸0.5 mg、Cu 7.5 mg、Zn 60 mg、Mn 60 mg、Fe 80 mg、Se 0.15 mg、I 0.35 mg。2.营养水平均为计算值。1.3饲养管理采用3层笼养方式，按照常规饲养管理要求，控制肉鸡舍内光照、湿度、温度。肉鸡自由采食、饮水。1.4测定指标及方法1.4.1样品采集试验第28、56 d，分别从每个重复随机选取1只肉鸡，采用断颈方式处死，取回肠中下段8 cm进行两端结扎，用锡箔纸包裹，液氮速冻，置于-80 ℃冰箱保存，送至基迪奥生物公司检测。1.4.2测定指标及方法从样本中提取基因组DNA后，用带有barcode的特异引物扩增16S rDNA的V3-V4区。将PCR扩增产物切胶回收，用QuantiFluorTM荧光计进行定量。将纯化的扩增产物进行等量混合，连接测序接头，构建测序文库，Hiseq2500 PE250上机测序。测序得到raw reads之后，对低质量reads进行过滤，进行组装和再过滤，以保证利用最有效数据聚类成OTU。获得OTU后，依次进行物种标注、α多样性分析、β多样性分析等。指标测定步骤见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.F001图1指标测定步骤1.5数据统计与分析采用Excel软件对试验数据进行统计，SPSS 19.0软件进行方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡回肠菌群OTUs及α多样性的影响（见图1、表2）由图1可知，28日龄时，饲喂新鲜大豆油和氧化大豆油肉鸡回肠内容物中共有OTUs 250个；饲喂新鲜大豆油的回肠特有OTUs 283个，饲喂氧化大豆油特有OTUs 99个，B组、C组、D组肉鸡回肠内特有OTU个数明显低于A组。新鲜大豆油组和氧化大豆油组56日龄肉鸡回肠共有OTUs 410个。56日龄时，饲喂新鲜大豆油肉鸡回肠特有OTUs 296个，饲喂氧化大豆油特有OTUs 440个，C组肉鸡回肠特有OTU个数明显高于A组、D组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.F002图1葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡回肠菌群OTUs的影响注：AB为新鲜大豆油组和新鲜大豆油+葛根素组；CD为氧化大豆油组和氧化大豆油+葛根素组；图2与此同。由表2可知，56日龄时，与饲喂新鲜大豆油相比，饲喂氧化大豆油肉鸡的回肠菌群Shannon指数显著升高（P0.05），氧化大豆油和葛根素对肉鸡回肠菌群Sobs和Chao1指数存在显著的交互作用（P0.05），且D组肉鸡回肠菌群Sobs指数和Chao1指数均显著低于C组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.T002表2葛根素对饲喂氧化大豆油肉鸡回肠菌群α多样性的影响项目新鲜大豆油氧化大豆油SEMP值A组B组C组D组P油脂P葛根P互作28日龄Sobs指数323.33a280.50ab265.67ab220.33b13.560.0580.1380.964Shannon4.93a2.65b2.46b3.55ab0.340.2730.4040.034Simpson指数0.860.580.550.700.060.4810.5910.128Chao1指数402.01378.28386.23340.4513.650.3520.2350.696Ace指数401.80396.91376.76325.2915.040.1420.3730.45956日龄Sobs指数356.17c472.33ab531.83a369.67bc17.930.3210.5290.001Shannon指数2.00b2.29b3.94a3.25ab0.240.0070.6770.319Simpson指数0.510.530.750.690.040.0140.7180.599Chao1指数502.04b671.68a699.72a512.98b19.930.6300.8320.001Ace指数498.66664.11713.71517.9217.340.3330.6670.001注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡回肠菌群结构的影响（见表3~表6）由表3~表6可知，各组肉鸡回肠在门水平上的优势菌门为Firmicutes、Bacteroidetes、Cyanobacteria、Proteobacteria；属水平上的优势菌属为Candidatus-Arthromitus、Lactobacillus、Sphingomonas。与饲喂新鲜大豆油相比，饲喂氧化大豆油56日龄肉鸡回肠在门水平Bacteroidetes、Synergistetes和属水平Ruminococcaceae_UCG-014的相对丰度升高。在门和属水平，回肠菌群结构、组成、种类大致相同，但物种丰度区别较大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.T003表3葛根素对饲喂氧化大豆油28日龄肉鸡回肠门水平菌群物种组成的影响项目新鲜大豆油氧化大豆油SEMP值A组B组C组D组P油脂P葛根P互作Firmicutes49.4076.8561.3961.856.700.9130.3250.340Proteobacteria11.1914.4732.4216.214.420.2260.4830.299Bacteroidetes17.734.432.0610.542.620.3850.6560.067Cyanobacteria17.990.271.760.594.060.3530.2740.334Actinobacteria1.81b1.22b1.31b8.52a0.880.0860.0930.054Epsilonbacteraeota0.541.910.781.270.470.8380.3500.653Chloroflexi0.250.240.010.580.160.8830.4090.397Verrucomicrobia0.550.030.180.010.130.4610.2090.534Deferribacteres0.000.360.010.000.120.4590.4590.458Deinococcus-Thermus0.060.000.000.390.090.3880.3810.245Other0.460.210.090.040.090.1510.4120.583Unclassified0.0100000.3230.3230.28310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.T004表4葛根素对饲喂氧化大豆油56日龄肉鸡回肠门水平菌群物种组成的影响项目新鲜大豆油氧化大豆油SEMP值A组B组C组D组P油脂P葛根P互作Firmicutes39.5041.6042.6943.515.650.8240.8980.956Proteobacteria51.2246.0330.8236.216.300.2450.9940.679Epsilonbacteraeota3.097.4913.1111.612.250.1320.7510.520Bacteroidetes0.951.336.623.920.890.0310.5230.400Actinobacteria4.090.731.350.750.620.2820.1220.275Cyanobacteria0.761.630.472.400.540.8270.2100.627Planctomycetes0.160.322.020.180.340.2170.2250.152Synergistetes0.02b0.09ab0.57ab0.91a0.130.0190.4540.620Fusobacteria0.000.011.000.040.220.2650.3010.291Verrucomicrobia0.150.150.280.110.050.6530.3560.356Other0.040.581.040.360.180.2870.8460.103Unclassified0.000.050.030.010.010.6600.4920.02410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.T005表5葛根素对饲喂氧化大豆油28日龄肉鸡回肠属水平菌群物种组成的影响项目新鲜大豆油氧化大豆油SEMP值A组B组C组D组P油脂P葛根P互作Candidatus_Arthromitus0.7436.2520.9648.107.560.3160.0680.788Lactobacillus17.3029.9732.070.939.430.7140.6360.275Sphingomonas1.798.0524.000.233.550.3360.2470.063Bacteroides4.461.380.893.061.040.6590.8320.237Barnesiella7.320.700.600.411.090.1430.1530.175Curvibacter0.792.361.581.960.350.7850.1940.417Faecalibacterium4.290.510.441.460.860.4210.4420.196Alistipes3.560.860.241.230.540.2040.4490.120Enterococcus1.771.422.010.230.450.6140.2690.449Helicobacter0.541.910.781.270.470.8380.3490.652Other31.46ab12.01b12.63b35.59a3.370.7330.8010.012Unclassified25.974.583.785.513.790.1940.2270.16110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.T006表6葛根素对饲喂氧化大豆油56日龄肉鸡回肠属水平菌群物种组成的影响项目新鲜大豆油氧化大豆油SEMP值A组B组C组D组P油脂P葛根P互作Sphingomonas49.0042.4220.9631.606.630.1570.8770.526Candidatus_Arthromitus19.0328.9017.3826.134.880.8230.3520.955Lactobacillus16.666.715.724.142.860.2510.3250.473Campylobacter2.420.245.1811.361.760.0620.5750.247Helicobacter0.677.257.930.251.590.9690.8640.036Ruminococcus_torques0.360.622.351.630.420.0900.7860.563Escherichia-Shigella0.010.144.470.131.010.2830.3090.281Faecalibacterium0.330.721.331.900.270.0550.3780.863Bacteroides0.370.431.581.680.310.5080.8950.976Ruminococcaceae_UCG-0140.100.361.091.010.190.0440.8160.664Other8.697.1520.9513.062.270.0590.3110.492Unclassified2.37b4.97ab11.05a7.11ab1.360.0600.8060.2432.3葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡回肠菌群β多样性的影响（见图2）由图2可知，主坐标氧化大豆油组（A组）肉鸡回肠各样品距离分散较远，与新鲜大豆油组肉鸡回肠样品基本分离。28日龄肉鸡回肠各样品分布较远，但每组样品距离接近。与其他组相比，氧化大豆油组（C组）56日龄肉鸡各回肠样品呈弥散形分布。28日龄、56日龄肉鸡回肠各样品存在部分交叉，表明4组肉鸡回肠菌群结构部分相似，但又存在差异。与C组相比，D组肉鸡回肠各样品距离更接近、均匀度更高，更接近A组。研究表明，氧化大豆油导致肉鸡回肠菌群结构改变，添加葛根素可一定程度上缓解肉鸡回肠菌群结构紊乱。图2葛根素对饲喂氧化大豆油黄羽肉鸡回肠菌群β多样性的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.F3a1（a）28 d PCoA分析 （b） 56 d PCoA分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.007.F3a2（c）28 d NMDS分析 （d） 56 d NMDS分析3讨论肠道菌群的稳态取决于菌群数量、丰度及不同菌群之间的相互作用[13-15]。有研究表明，饮食会影响肠道细菌群落的组成[16]。肠道炎症与肠道菌群失衡有关[17-18]。据报道，食用氧化大豆油可降低家鼠肠道菌群的丰富度及多样性指数[19]。OTU丰度韦恩图可反映菌落分布的相似性质和差异性。肠道菌群α多样性分析中Chao1/Ace指数可反映样本的物种丰富度。物种的种类和分布情况可以通过Simpson/Shannon指数显示。本试验中，饲喂氧化大豆油可减少28日龄肉鸡回肠菌群特有OTUs数目，增加56日龄肉鸡回肠菌群特有OTUs数目，升高56日龄肉鸡回肠内容物菌群Shannon指数。原因可能是饲喂氧化大豆油增加了肉鸡回肠中部分有害菌的数量，从而引起菌群稳态失衡。本试验中，PCA主成分分析和PCoA主坐标分析结果显示，各组肉鸡回肠菌群部分样品有交叉，意味着各组样本菌群结构部分相似，但又存在差异部分。通过β多样性发现，各组间样本未发生重叠，表明各组间肉鸡回肠菌群组成存在明显差异。李娇娇[20]研究表明，添加葛根素可调节共生菌群的组成，有助于改善肠道屏障功能。Zhang等[21]研究发现，葛根素可增加肠道菌群的多样性。本研究发现，饲粮中添加葛根素可抑制由氧化大豆油引起的肉鸡回肠菌群变化，减少氧化大豆油对肉鸡回肠菌群的负面影响，促进了肠道菌群的稳定。肠道中含有许多致病菌，福氏志贺菌可通过3型分泌系统（T3SS）破坏肠上皮紧密连接等有害菌。本试验中，肉鸡回肠中门水平上的优势菌群为厚壁菌门和拟杆菌门，与Li等[22]研究一致。本试验中，肉鸡回肠中属水平的优势菌属包括Candidatus-Arthromitus、Lactobacillus、Sphingomonas。有研究表明，热应激条件增加了肉鸡黏膜互养菌门和拟杆菌门的丰度[23-24]，与本研究结果一致。本试验中，在门和属水平上，肉鸡回肠中菌群结构、组成、种类大致相同，但物种丰度区别较大。原因可能与饲粮、个体差异、环境等有关。据报道，遗传、日龄、饲粮、生长环境等因素均可导致动物机体肠道菌群差异[25]。本试验中，在新鲜大豆油中添加葛根素，肉鸡回肠中Actinobacteria比例明显低于新鲜大豆油组，在氧化大豆油中添加葛根素Actinobacteria比例明显低于氧化大豆油组。据报道，Actinobacteria为致病菌，放线菌门增多引发肠道炎症[26]。饲粮中添加葛根素可降低放线菌门丰度，表明葛根素可在一定程度上降低肉鸡肠道菌群中的有害菌数量。4结论本研究表明，饲喂氧化大豆油会改变肉鸡回肠菌群特有OTUs数目、菌群的物种数量、菌群结构及物种丰度，引起肉鸡肠道菌群紊乱。饲粮中添加葛根素可减少56日龄肉鸡回肠菌群特有OTU数目，缓解氧化大豆油引起的肉鸡肠道菌群失衡。