红薯渣是红薯淀粉的副产物，主要由淀粉、纤维素和少量粗蛋白组成[1]。将红薯渣常当作废料丢弃，容易造成资源浪费。固态发酵技术可提高红薯渣营养成分含量，降低饲料成本，提高养殖的经济效益[2-4]。在水产养殖中，可以采用发酵饵料。发酵饵料主要靠其中的微生物或微生物的代谢产物发挥作用[5-6]。发酵饵料可以改善饵料营养指标，提高饵料消化率，提高水产动物的生长性能[7-8]。研究表明，肠道微生物群组成与机体健康之间存在联系，肠道微生物群可以通过发酵产物以靶向的方式对肠道进行有益调节[9-10]。但关于发酵产物发挥益处的作用机制研究较少[11]。因此，本研究以鲤鱼为研究对象，探究发酵红薯渣（FSP）对鲤鱼肠道微生物群的影响，以期为发酵红薯渣在鲤鱼生产中的应用研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料红薯渣由贵州省动物生物制品工程技术研究中心自制。产朊假丝酵母（ACCC 20060）、植物乳杆菌（ACCC 11095）购自上海保藏生物科技有限公司。酿酒酵母与粪肠球菌保存于贵州省动物生物制品工程技术研究中心。α-淀粉酶试剂盒、总蛋白酶试剂盒、脂肪酶试剂盒，均购自上海凡科维生物科技有限公司。1.2试验设计与饲养管理发酵红薯渣添加量参照吴灵丽等[12]的结果。选取120尾健康无病、初始体重为（408.36±26.12）g的鲤鱼，随机分为4组，即FSP0组、FSP10组、FSP20组、FSP30组分别在基础饵料中添加0、10%、20%、30% FSP，每组3个重复，每个重复10尾鲤鱼。试验期42 d。鲤鱼饲养于12个网格箱（1.5 m × 1.5 m × 2 m）中，每天投喂2次，投喂量为鲤鱼总质量的2%。试验期间水温为20~30 ℃，pH值为7.0~7.5，溶解氧含量大于5.0 mg/L，氨氮含量小于0.01 mg/L。将活菌数均为1×109 CFU/mL的产朊假丝酵母、植物乳杆菌、酿酒酵母和粪肠球菌按照1∶1∶1∶1混匀。红薯渣中添加7%（体积质量比）的复合菌液，32 ℃发酵3 d。发酵红薯渣营养成分见表1。原料经粉碎后制成2.5 mm颗粒饵料，4 ℃冷藏。基础饵料组成及营养水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.T001表1发酵红薯渣营养成分项目粗蛋白质/%粗纤维/%粗脂肪/%粗灰分/%总糖/(mg/g)淀粉/(mg/g)未发酵红薯渣3.28±0.0216.74±0.790.35±0.031.82±0.0670.51±1.25207.14±1.66发酵红薯渣4.54±0.4423.22±0.790.50±0.012.18±0.0790.01±3.97353.84±2.6410.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.T002表2基础饵料组成及营养水平项目FSP0组FSP10组FSP20组FSP30组原料组成豆粕25.0026.0029.0032.00菜籽粕20.0019.0015.008.00鱼粉15.0016.0017.4719.90小麦次粉20.0014.007.003.00玉米13.508.505.501.20发酵红薯渣010.0019.5329.40豆油2.002.002.002.00鱼油2.002.002.002.00磷酸二氢钙1.501.501.501.5050%氯化胆碱0.200.200.200.20多维预混料0.400.400.400.40矿物质预混料0.400.400.400.40合计100.00100.00100.00100.00营养水平粗蛋白32.4832.3132.0232.01粗脂肪5.395.415.385.35注：1.多维和矿物质预混料为每千克饵料提供：VA 50 000 IU、VD3 50 000 IU、VE 500 IU、VC 2.5 mg、VK 250 mg、VB1 50 mg、VB2 50 mg、VB6 50 mg、VB12 0.125 mg、生物素5 mg、烟酸 25 mg、叶酸 15 mg、泛酸 250 mg、Fe 185 mg、Mn 35 mg、Cu 5 mg、Ca 0.275 mg、Zn 30 mg、Co 0.05 mg、I 2.5 mg、Se 0.125 mg。2.营养水平均为计算数值。%1.3测定指标及方法1.3.1生长性能生长性能相关指标的计算公式为：存活率(SR)=Nt/N0×100%(1)增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%(2)特定生长率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%(3)肥满度(CF)=Wt/Lt3×100%(4)式中：Nt为采样时存活鲤鱼尾数；N0为试验初始鲤鱼尾数；Wt为采样时鲤鱼体重（g）；W0为初始鲤鱼体重（g）；Lt为采样时鲤鱼体长（cm）；t为试验天数（d）。1.3.2肠道消化酶取约0.1 g组织，加入1 mL提取液，冰浴匀浆，按照BAC蛋白试剂盒说明书测定蛋白质浓度；4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，置于冰上。肠道消化酶测定按照α-淀粉酶试剂盒、总蛋白酶试剂盒与脂肪酶试剂盒说明书进行操作。1.3.3肠道菌群采集肠道前鲤鱼禁食24 h，经液氮速冻2 h，-80 ℃冻藏。将鲤鱼肠道样品送至深圳华大基因科技服务有限公司进行DNA的提取和测序。取质量合格的基因组DNA样品30 ng及对应的融合引物配置PCR反应体系，进行PCR扩增；使用Agencourt AMPure XP磁珠对PCR扩增产物进行纯化，溶于Elution Buffer，完成建库；使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测，合格的文库根据插入片段大小，选择HiSeq平台进行测序；对Reads拼接过滤，得到有效数据（Clean data），通过Reads之间的Overlap关系将Reads拼接成Tags；将Tags聚类成OTU并与数据库比对、物种注释，进行样品物种复杂度分析，组间物种差异分析、关联分析与模型预测。1.4数据统计与分析采用Excel软件对试验数据进行统计，SPSS 23.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1发酵红薯渣对鲤鱼生长性能影响（见表3）由表3可知，FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼增重率和特定生长率均高于FSP0组，但差异均不显著（P0.05）。FSP20组鲤鱼增重率和特定生长率均最高。各组鲤鱼存活率和肥满度均无显著差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.T003表3发酵红薯渣对鲤鱼生长性能影响组别初始体重/g终末体重/g存活率/%增重率/%特定生长率/(%/d)肥满度/(g/cm3)FSP0组424.67±21.73545.00±11.79b100.00±0.0028.46±3.78ab0.60±0.07b20.66±2.46FSP10组404.67±28.10570.00±14.73a100.00±0.0041.15±6.68a0.82±0.11a22.03±3.11FSP20组393.33±27.39557.67±4.51ab100.00±0.0042.20±9.18a0.84±0.15a22.48±0.67FSP30组427.00±24.81560.33±15.31ab100.00±0.0031.26±2.81ab0.65±0.05ab20.09±0.88注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2发酵红薯渣对鲤鱼消化酶活性的影响（见表4）由表4可知，鲤鱼肠道中淀粉酶活性随发酵红薯渣添加量增加呈上升趋势。FSP30组鲤鱼肠道中淀粉酶活性显著高于其他各组（P0.05）。FSP30组鲤鱼肠道中蛋白酶活性最低，且显著低于FSP10组（P0.05）。FSP30组脂肪酶活性显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.T004表4红薯渣对鲤鱼消化酶活性的影响组别淀粉酶蛋白酶脂肪酶FSP0组5.50±0.31b5.42±0.12ab323.09±12.94bFSP10组5.60±0.22b6.23±0.72a309.01±12.40bFSP20组5.84±0.13b5.16±1.13ab287.91±14.33bFSP30组8.50±2.13a3.56±0.82b499.88±11.61aU/g2.3发酵红薯渣对鲤鱼肠道菌群的影响2.3.1鲤鱼肠道样品测序结果（见图1）在97%序列相似性条件下绘制的稀释曲线，横轴反映鲤鱼肠道菌群的丰富度，纵轴反映鲤鱼肠道菌群分布的均匀情况。由图1可知，随着测序深度的增加，FSP0组、FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道菌群稀释曲线趋于平缓，表明各组鲤鱼肠道测序数据合理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.F001图1鲤鱼肠道样品测序结果2.3.2鲤鱼肠道菌群Venn图（见图2）由图2可知，FSP0组鲤鱼肠道特有OTU数为50种。FSP10组鲤鱼肠道特有OTU数为40种。FSP20组鲤鱼肠道特有OTU数为48种。FSP30组鲤鱼肠道特有OTU数为24种。FSP30组鲤鱼肠道特有OTU数低于FSP0组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.F002图2鲤鱼肠道菌群Venn图2.3.3鲤鱼肠道菌群Alpha多样性指数（见表5）由表5可知，各组Coverage指数均大于0.99，说明各组鲤鱼肠道菌群分布较均匀。FSP30组鲤鱼肠道菌群Sobs指数显著低于其他各组（P0.05），各组鲤鱼肠道菌群Chao指数、ACE指数均无显著差异，表明饲喂30%发酵红薯渣可降低鲤鱼肠道菌群的物种丰富度和多样性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.T005表5鲤鱼肠道菌群Alpha多样性指数组别Sobs指数Chao指数ACE指数Shannon指数Simpson指数Coverage指数FSP0组74.33±21.13a79.48±24.3979.81±23.111.68±0.82a0.33±0.17b0.999 9±0.000 8FSP10组59.33±7.78a64.96±12.6964.96±10.760.94±0.41a0.56±0.19b0.999 9±0.000 7FSP20组59.33±3.21a71.00±12.6264.28±4.450.95±0.67a0.60±0.29b0.999 9±0.000 4FSP30组43.67±8.74b58.33±25.0151.76±13.820.20±0.14b0.94±0.04a0.999 9±0.000 32.3.4鲤鱼肠道微生物在门和属水平上的差异分析（见图3、图4）由图3可知，各组鲤鱼肠道中共有的主要优势菌群为变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、螺旋体门（Spirochaetes）、放线菌门（Actinobacteria）。FSP0组、FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道变形菌门的相对丰度分别为68.77%、85.38%、89.27%、98.55%。随发酵红薯渣的增加，变形菌门（Proteobacteria）的相对丰度上升。与FSP0组比，FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道变形菌门的相对丰度显著增加（P0.05）。FSP0组、FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道厚壁菌门的相对丰度分别为20.58%、12.80%、6.99%、0.60%；随发酵红薯渣的增加相对丰度逐渐下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.F003图3鲤鱼肠道微生物在门水平上的差异分析由图4可知，FSP0组、FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道中主要包括气单胞菌属（Aeromonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）及螺旋菌属（Brevinema）。FSP0组、FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道单胞菌属相对丰度分别为48.85%、24.86%、13.93%、0.53%；随发酵红薯渣的增加逐渐下降。与FSP0组比，FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道单胞菌属相对丰度显著降低（P0.05）。FSP0组、FSP10组、FSP20组、FSP30组鲤鱼肠道黄杆菌属相对丰度分别为5.10%、0.56%、0.11%、0.17%；Malikia相对丰度分别为3.04%、0、0、0.20%；螺旋菌属相对丰度分别为2.14%、0.67%、1.62%、0.36%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.012.F004图4鲤鱼肠道微生物在属水平上的差异分析3讨论3.1发酵红薯渣对鲤鱼生长性能的影响Sugiharto等[13]研究表明，发酵饵料可为水产动物提供益生菌及其代谢产物。本试验中，饲喂42 d鲤鱼增重率随发酵红薯渣增加呈先升高后降低趋势，其中添加20%发酵红薯渣鲤鱼增重率显著提高。有研究表明，利用发酵红薯渣饲喂肉牛，可提高肉牛生长性能[14]，与本试验结果相一致。本试验中，添加20%发酵红薯渣显著提高了鲤鱼生长性能，与樊懿萱等[15]研究结果一致。因此，采用发酵红薯渣饲喂鲤鱼的适宜添加量为20%。3.2发酵红薯渣对鲤鱼肠道消化酶活性的影响鱼类分解食物的能力与肠道消化酶及饵料性质有关[16]。鲤鱼的肌肉由16%~18%蛋白质组成，对饵料蛋白质需求极高[17]。鲤鱼对蛋白质的分解吸收与蛋白酶活性有关[18]。益生菌发酵产生脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶及淀粉酶，可将糟渣中蛋白质及纤维素降解为单糖和多肽，使机体更容易吸收[19]。本试验中，饲喂添加10%的发酵红薯渣可促进鲤鱼肠道蛋白酶分泌，20%发酵红薯渣对鲤鱼肠道蛋白酶无显著影响，30%的发酵红薯渣抑制蛋白酶分泌。本研究表明，适量添加发酵红薯渣对鲤鱼肠道中蛋白酶的分泌具有促进作用，添加过量则会抑制蛋白酶的分泌。添加30%发酵红薯渣显著提高鲤鱼肠道中淀粉酶和脂肪酶活性，降低蛋白酶活性，表明发酵红薯渣可调节肠道消化酶的分泌，与刘莹露等[20]研究结果一致。3.3发酵红薯渣对鲤鱼肠道菌群的影响肠道微生物群在营养、生理学和肠道形态学中起到重要作用，包括物质代谢、生物屏障、免疫调控及宿主防御等[21]。气单胞菌广泛分布在淡水水生环境中，属于淡水鱼类内源性菌群，是重要的腐败细菌，参与有机化合物发酵及纤维素降解。气单胞菌能产生运动性气单胞菌败血症的致病因子，会降低水产品质量，导致水产集约化养殖产生巨大的经济损失。黄杆菌广泛存在于淡水、海水、土壤和植物中，是一种常见的鱼类病原体，引起柱状病，影响养殖和野生淡水鱼的健康，从而造成水产养殖的经济损失。本试验中，饲喂30%发酵红薯渣显著增加鲤鱼肠道变形菌门相对丰度，降低厚壁菌门相对丰度。乳酸杆菌属被广泛用于固态发酵，可产生有机酸（主要是乳酸、丙酸及丁酸），降低底物的pH值，用乳酸杆菌饲喂动物可降低肠道内的致病菌[22]。酵母菌属发酵会产生酵母菌菌体蛋白、酵母菌壁碎片和代谢产物，可以阻断部分细菌与肠道上皮的结合[23]。本试验中，30%的发酵红薯渣显著降低鲤鱼肠道微生物多样性，与FSP0组比，鲤鱼肠道变形菌门丰度显著增加，厚壁菌门丰度显著降低，主要减少的条件致病菌包括气单胞菌属、黄杆菌属及螺旋菌属，与He等[24]、郝凌魁等[25]研究结果一致。4结论本研究表明，添加20%发酵红薯渣可提高鲤鱼生长性能；添加30%发酵红薯渣影响鲤鱼肠道消化酶活性，降低鲤鱼肠道菌群的相对丰富度。因此，本研究推荐添加20%发酵红薯渣饲喂鲤鱼。