蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）是一种球形单细胞淡水藻类，直径3~8 μm，为绿藻门小球藻属，是一种高效的光合植物[1]，富含蛋白质、脂质、多种维生素、必需氨基酸和微量元素等[2]。细胞内含有一种生长因子，能够强化免疫功能。小球藻还具有调节血脂、抗衰老、预防贫血和调节肠道微生物群等作用[3-6]，是一种优异的营养补充剂。研究表明，将小球藻以10 g/d添加到日粮中，不仅增加了泌乳波尔山羊每日产奶量、能量校正产奶量、乳脂、乳糖含量等，还增加了总不饱和脂肪酸浓度（提高5.4%）[7]。此外，在日粮中添加小球藻增加了大马士革山羊羊奶中总多不饱和脂肪酸和总共轭亚油酸的比例[8]。含有小球藻的青贮饲料可以有效降低羊的渐近总产气量、CH4和CO2产量及瘤胃原虫数量，缩短CH4产生的滞后时间[9]。用添加小球藻的日粮喂养猪、鸡、兔和鲷鱼，可以提高禽畜、水产等产品质量[10-14]。蛋白核小球藻在环境污染防治中可以起到良好的效果，如对重金属含量过高、高磷等污水的治理具有良好效果[15-18]。蛋白核小球藻还可以作为生物柴油生产的主要载体[19-20]。周有彩[21]利用50 L发酵罐建立的小球藻发酵补料工艺，在2 000 L发酵罐进行中试培养试验，最终细胞干重为81.6 g/L，蛋白含量水平达到34.6%，但仍无法满足未来发展需求。本研究对复合碳源、氮源和维生素等13种因子进行Plackett-Burman筛选，选取复合碳源（葡萄糖+淀粉）、有机氮源（尿素）、VB12共3个因素进行Box-Benhnken试验，用响应面分析法对蛋白核小球藻的发酵工艺进行优化，通过响应曲面分析得到各因素的最佳取值，并利用优化结果进行补料工艺优化，进一步提高了发酵水平，为小球藻高密度发酵的放大生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1主要材料蛋白核小球藻由华北制药集团新药研究开发有限责任公司菌种保藏中心提供。1.1.2培养基初始培养基：葡萄糖20.000 g/L、MgSO4·7H2O 1.200 g/L、柠檬酸钠0.200 g/L、CaCl2 0.120 g/L、FeSO4·7H2O 0.016 g/L、EDTA 0.005 g/L、KH2PO4 2.200 g/L、微量元素母液1.000 mL/L，pH值为6.500。其中微量元素母液：H3BO3 2.860 g/L、ZnSO4·7H2O 0.222 g/L、MnCl2·4H2O 2.000 g/L、NaMoO4 0.015 g/L、CuSO4·2H2O 0.070 g/L，pH值为6.700。PB筛选培养基：不添加葡萄糖，其余同初始培养基。响应面试验培养基：不添加葡萄糖，其余同初始培养基。1.1.3试验仪器TU-1900型双束光紫外分光光度计（北京普析通用仪器公司），64R型高速冷冻离心机（BECKMAN），JJ2000型电子天平、JJ224BC型分析天平（G&G），BCM-1600A型超净工作台（AIRTECH），DZF-6050型真空干燥箱（上海简户仪器设备有限公司），KT200型自动凯氏定氮仪（FOSS），LMQ.C-100E型高压蒸汽灭菌锅（济南来宝医疗器械有限公司），MODEL 828型酸度计（奥立龙），NewBrunswickInnova 2300型摇床（Eppendorf艾本德），LRH-150-SH型恒温恒湿培养箱（广东泰宏君科学仪器股份有限公司），DM750型生物显微镜（上海徕卡显微系统有限公司）。1.2试验方法1.2.1培养方法将蛋白核小球藻保藏种液以10%的接种量接种于装有15 mL培养基的50 mL三角瓶中，30 ℃、100 r/min振荡培养4 d，将培养好的种子液以5%的接种量接种于装有100 mL培养基的250 mL三角瓶中，30 ℃、100 r/min振荡培养7 d。1.2.2标准曲线使用干重为15 g/L的培养藻液进行不同梯度稀释，用双束光紫外分光光度计测定各梯度680 nm处的光密度值，并制作标准曲线。1.2.3蛋白核小球藻生物量OD值测定方法为摇瓶藻液稀释100倍，50 L发酵罐藻液稀释500倍，用双束光紫外分光光度计测定680 nm处的光密度值，表示蛋白核小球藻细胞浓度[22]。1.2.4蛋白核小球藻蛋白量采用FOSS公司的半自动凯氏定氮仪测定蛋白质含量。1.2.5补料方法50 L发酵罐培养30 h后，开始恒速添加复合碳源和尿素，控制总糖量在0.5%~1.5%，总氮量为500 mg/L，恒速添加补料到96 h，开始停加尿素，直至发酵结束。1.3试验设计1.3.1复合碳源试验设计在前期逐因子试验的基础上，发现葡萄糖对提高藻体密度有着很好的效果，淀粉和麦芽糖有提高藻蛋白含量的效果。因此，进一步试验探究提高藻体密度和蛋白含量的碳源组合比例。复合碳源试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.T001表1复合碳源试验设计组合比例复合碳源A复合碳源B葡萄糖麦芽糖葡萄糖淀粉5.0∶1.050.010.050.010.02.5∶1.025.010.025.010.01.0∶1.010.010.010.010.01.0∶2.510.025.010.025.01.0∶5.010.050.010.050.0g/L1.3.2Plackett-Burman试验设计在前期逐因子试验的基础上，结合复合碳源试验结果，选取复合碳源A、复合碳源B、无机氮源、有机氮源、维生素作为试验考察因素，每个因素取高低两个水平，采用Design-Expect软件进行Plackett-Burman设计。PB试验设计各因素编码水平见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.T002表2PB试验各因素编码水平因素编码水平-11X1复合碳源A10.030.0X2复合碳源B10.030.0X3硫酸铵0.51.0X4硝酸钾0.20.5X5酵母粉6.08.0X6尿素8.010.0X7 VB10.10.3X8 VB20.10.3X9 VB30.20.5X10 VB50.20.5X11 VB60.20.5X12 VB120.20.5X13 VC0.10.3g/L1.3.3响应面试验设计根据PB试验和最陡爬坡试验确定的因素和水平结果，采用Box-Behnken设计进行响应面分析试验。Box-Behnken试验因素水平设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.T003表3Box-Behnken试验因素水平设计因素编码水平-11A复合碳源B515B尿素812C VB120.30.5g/L1.3.4生物学观察使用生物显微镜对优化好的配方培养藻液与对照进行观察和对比。1.3.5培养基及补料优化试验利用软件分析及优化后的最佳添加量分别在250、1 000 mL两种不同规格的三角瓶进行试验。在50 L发酵罐中由初期工艺的补料葡萄糖改为补料复合碳源和尿素，补料条件见1.2.5。2结果与分析2.1标准曲线蛋白核小球藻的标准曲线见图1。经软件分析所得标准曲线方程为：y=3.352x + 0.314 4，R2=0.996 8。由此可得到：摇瓶藻液干重=y-0.314 43.352×100；发酵藻液干重=y-0.314 43.352×500。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F001图1蛋白核小球藻标准曲线2.2复合碳源试验设计张维国[23]研究表明，不同碳源单独添加对于蛋白核小球藻的不同生化特性影响不同，其结果与本研究早期试验结果相似，故尝试以葡萄糖和麦芽糖、淀粉组合成不同复合碳源，寻找适合蛋白核小球藻发酵培养的复合碳源。两种复合碳源试验结果见图2。由图2可知，在复合碳源A中，葡萄糖与麦芽糖比例为1.0∶1.0时，藻量最高，而比例为1.0∶2.5时，蛋白含量最高，但与1.0∶1.0时差距不大，葡萄糖与麦芽糖比例最终选择为1.0∶1.0进行下一步试验。在复合碳源B中，葡萄糖与淀粉比例为2.5∶1.0时藻体密度和蛋白均能够达到最高值，葡萄糖与淀粉比例最终选择2.5∶1.0进行下一步试验。图2两种复合碳源试验结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F2a1（a）复合碳源A10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F2a2（b）复合碳源B2.3PB试验设计筛选小球藻发酵生产的关键影响因子根据Plackett-Burman试验设计进行试验，得到OD680 nm结果输入Minitab19软件中，即得到显著效应因子。PB试验设计结果见表4，Pareto图见图3，方差分析见表5。由表4、图3和表5可知，在α=0.05水平上具有显著效应的因子为复合碳源B、尿素和VB12。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.T004表4PB试验设计及结果标准序运行序复合碳源A/(g/L)复合碳源B/(g/L)硫酸铵/(g/L)硝酸钾/(g/L)酵母粉/(g/L)尿素/(g/L)VB1/(g/L)VB2/(g/L)VB3/(g/L)VB5/(g/L)VB6/(g/L)VB12/(g/L)VC/(g/L)OD680 nm值3130201.000.208100.10.10.500.500.200.200.10.57819230100.500.206100.30.20.500.200.500.200.30.54029320200.750.35790.20.20.350.350.350.350.20.44122410101.000.508100.30.10.350.200.200.200.30.42512510100.500.50690.10.10.500.500.200.500.30.44011630301.000.20890.30.30.200.200.500.200.10.15816710301.000.206100.10.30.200.200.200.350.30.16423830301.000.20680.30.10.500.350.200.500.30.12918910301.000.50680.20.10.500.200.500.200.10.19841010200.500.50680.30.30.200.200.500.500.30.409141110300.500.20880.30.10.200.500.350.200.30.20781210300.500.356100.30.30.500.500.200.200.10.217101310101.000.20780.10.30.500.500.500.200.30.352251430101.000.50680.30.30.200.500.200.200.20.44411520301.000.508100.30.30.500.500.500.500.30.554131630101.000.506100.10.30.500.200.350.500.10.55571730101.000.35880.10.10.200.200.500.500.30.464151830100.500.50880.30.10.500.500.500.350.10.525261910300.500.208100.10.10.500.200.500.500.20.391212030300.500.20680.10.30.350.500.500.500.10.101172130100.500.208100.20.30.200.500.200.500.30.57792230300.500.507100.30.10.200.200.200.500.10.64362310100.750.20880.30.30.500.200.200.500.10.497272430300.500.50880.10.30.500.200.200.200.30.159202510301.000.50880.10.20.200.500.200.500.10.22222620100.500.20680.10.10.200.200.200.200.10.30152730300.750.506100.10.10.200.500.500.200.30.200282810101.000.206100.30.10.200.500.500.500.10.655242910100.500.508100.10.30.200.350.500.200.10.47810.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F003图3Pareto图注：响应值为OD680 nm值，α=0.05。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.T005表5PB试验方差分析结果项目自由度离均差平方和均方差F值P值误差150.153 4200.010 228模型130.661 3000.050 8694.970.002线性130.661 3000.050 8694.970.002复合碳源A10.006 7200.006 7200.660.430复合碳源B10.325 6960.325 69631.840.000硫酸铵10.000 3120.000 3120.030.864硝酸钾10.013 9390.013 9391.360.261酵母粉10.029 9200.029 9202.930.108尿素10.149 1140.149 11414.580.002VB110.038 3080.038 3083.750.072VB210.009 2720.009 2720.910.356VB310.001 7450.001 7450.170.685VB510.001 0860.001 0860.110.749VB610.002 0170.002 0170.200.663VB1210.073 2460.073 2467.160.017VC10.009 9260.009 9260.970.340回归方程为：Y=-0.569+0.001 61 X1-0.011 19 X2-0.013 80X3+0.154X4+0.033 90X5+0.075 70X6+0.384 00X7-0.189 00X8+0.055X9+0.043 00X10+0.059 00X11+0.354 X12-0.195X13。培养基初始pH值、培养温度和摇床转速也是试验中重要的因素，但多次试验发现适宜条件与前期逐因子试验结果近似，最终选择培养基初始pH值6.8、培养温度30 ℃、摇床转速100 r/min。2.4响应面优化试验对筛选得到的影响较大的3个因子复合碳源B、尿素和VB12进行响应面试验，按照软件Design-Expert 12 Perfect中的Box-Behnken Design生成的试验设计表进行试验。残差正态分布图见图4，响应面优化试验设计结果见表6，方差分析结果见表7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F004图4残差正态分布图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.T006表6响应面优化试验设计及结果标准序运行序A复合碳源B/(g/L)B尿素/(g/L)C VB12/(g/L)OD680 nm值4120.0120.50.1347215.0100.30.58611317.580.30.44410417.5120.40.3625515.0100.40.6096620.0100.40.2319717.580.40.4392820.080.50.3121915.080.50.505121017.5120.30.126131117.5100.50.44281220.0100.30.143151317.5100.50.409141417.5100.50.45331515.0120.50.46210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.T007表7响应面试验方差分析结果项目离均差平方和自由度均方差F值P值模型0.325 1690.036 1310.101 390.010 12A0.225 1210.225 1262.942 010.000 51B0.047 4310.047 4313.261 630.014 88C0.014 6210.014 624.087 780.099 14AB0.004 5510.004 561.273 890.310 26AC0.001 0610.001 060.295 320.610 17BC0.014 5210.014 524.059 750.100 02A²0.000 9410.000 940.262 910.629 97B²0.015 8210.015 824.423 370.089 39C²0.002 5810.002 580.722 680.434 07残差0.017 8850.003 58失拟项0.016 8330.005 6110.702 160.086 66自然误差0.001 0520.000 52总和0.343 0414由表7可知，模型项显著（P0.05），失拟项不显著（P=0.086 60.05），残差正态分布明显趋近于直线，表明该模型选择合适。各因素间交互作用对OD680 nm值的影响见图5，显著效应因子优化叠加见图6。由图5、图6可知，复合碳源B分别和尿素、VB12具有较好的交互作用，但尿素和VB12交互作用不明显；各因子最佳添加量为复合碳源B 7.4 g/L、尿素8.8 g/L、VB12 0.4 g/L，预测OD680 nm值为0.791。图5各因素间交互作用响应面和等高线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F5a1（a）复合碳源B与尿素对OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F5a2（b）复合碳源B与VB12对OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F5a3（c）尿素与VB12对OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F006图6显著效应因子优化叠加（a） 复合碳源B和尿素优化叠加 （b） 复合碳源B和VB12优化叠加2.5生物学观察结果使用DM750型生物显微镜对培养好的藻液进行观察，观察结果见图7。由图7可知，对照组小球藻个体小、颜色浅，使用优化培养基的小球藻个体大、颜色深，生长状态优于对照组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F007图7藻液生物学观察结果2.6培养基及补料优化结果通过筛选并优化具有显著效应因子的添加量，即复合碳源B（葡萄糖∶淀粉=2.5∶1.0）7.4 g/L；尿素8.8 g/L；VB12 0.4 g/L，其余与初试培养基相同，在250 mL和1 000 mL三角摇瓶中进行培养基试验，并在50 L发酵罐中进行新的补料发酵工艺试验，试验结果见图8。采用50 L发酵罐培养30 h后，开始恒速添加复合碳源和尿素，恒速添加补料到96 h，开始停加尿素，直至发酵结束的工艺，最终发酵液的OD680 nm值达到0.929，得到干重91.64 g/L，蛋白浓度达到43%，高于摇瓶发酵。3个不同水平发酵均高于对照组，藻体密度分别提高38.9%、31.1%、42.5%，蛋白浓度分别提高29.8%、31.0%、31.4%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.016.F008图8物料添加优化验证3结论蛋白核小球藻作为一种常见的光合植物，不仅具有富含碳水化合物、脂肪酸以及蛋白质等营养物质等特点，还具有多种对人体健康有益的生长因子，是极具发展潜力的营养保健品。本试验从多因素角度出发，通过Plackett-Burman试验筛选得到适合蛋白核小球藻高密度高蛋白发酵的3个显著效应因子，复合碳源为葡萄糖和淀粉，按2.5∶1.0的比例添加能够有效增加核蛋白小球藻发酵产量，尿素和VB12也能够明显促进蛋白核小球藻的高密度发酵。Box-Behnken Design响应面分析优化得到的合适添加量分别为复合碳源7.4 g/L、尿素8.8 g/L、VB12 0.4 g/L。经250 mL和1 000 mL三角摇瓶培养基试验验证以及50 L发酵罐补料工艺验证，3个不同水平发酵的效果均高于对照组，藻体密度分别提高38.9%、31.1%、42.5%，蛋白浓度分别提高29.8%、31.0%、31.4%。新的补料条件下，蛋白核小球藻50 L发酵罐OD680 nm值为0.929，干重为91.64 g/L，蛋白含量达43%。