纤维素降解菌是一类存在于家畜动物消化道且具有降解纤维素能力的细菌。以马和牛为代表的食草动物会进食大量富含纤维的植物。进入瘤胃和大肠的大多数植物纤维都是不溶性结构形式[1]，而动物本身分泌的消化酶并不能对纤维素进行消化[1-2]，因此动物对植物纤维的消化利用主要依靠消化道内的共生微生物分泌的纤维素酶将纤维素分解为可供机体进行消化吸收的产物[3]。例如，马的盲肠和结肠微生物群落和反刍动物的瘤胃微生物群落都是天然的纤维素降解系统。响应面法使用统计和数学工具，用于开发、改进和优化受多种因素影响的试验过程[4]。响应面法可检测输入因素的变化，分析和量化各因素对输出结果的影响以及因素间相互影响的重要性[5]。因此，响应面法不仅为每个变量提供最佳水平，而且还可评估各因素之间的相互作用及其对1个或多个测量响应的影响[6]。本研究旨在通过响应面法优化纤维素降解菌的培养条件和纤维素酶酶促反应的条件，为工业化生产奠定基础。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1供试菌种纤维素降解菌种CE41，从新疆伊犁马盲肠内容物中分离驯化获得，由石河子大学生命科学学院保存。1.1.2培养基LB培养基：0.5%酵母提取物、1% NaCl、1%胰蛋白胨。LB发酵培养基：CMC-Na、0.5%酵母提取物、1% NaCl、1%胰蛋白胨。1.1.3主要试剂羧甲基纤维素钠、酵母提取物、胰蛋白胨、盐酸、DNS、柠檬酸钠、柠檬酸（索莱宝试剂有限公司）；氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（国药集团化学试剂有限公司）。1.1.4试验仪器高压灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、摇床、烘箱、电子天平、离心机、水浴锅、PCR仪、微波炉、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、-20 ℃冰箱、-80 ℃冰箱、磁力搅拌器、移液器。1.2试验方法1.2.1CE41的活化培养从-80 ℃冰箱中取出冻存的菌株，接种于LB液体培养基中，于37 ℃、180 r/min过夜振荡培养，以1%的比例接种到LB液体培养基中，进行第二次活化，待菌液的OD600 nm值达到1.0时，按10%接种到LB发酵液体培养基中，于37 ℃、180 r/min振荡培养48 h。1.2.2纤维素降解菌CE41的酶学性质测定采用DNS法检测还原糖含量，测定样品在540 nm波长下的OD值，把OD值带入葡萄糖标准曲线得到还原糖含量，判断纤维素酶的培养温度和耐酸碱能力，计算相对酶活力。相对酶活力=被测酶的活力/标准酶的活力×100%(1)1.2.3纤维素降解菌培养条件的筛选对纤维素降解菌CE41培养条件进行单因素试验及响应面优化试验。选择培养温度、培养基pH值和接种量3个培养条件因素对纤维素降解菌CE41中的纤维素酶活力的影响进行单因素试验，试验进行3次重复。纤维素降解菌培养条件的单因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T001表1纤维素降解菌培养条件的单因素水平设计水平A培养温度/℃B培养基pH值C接种量/mL130542356634078445810550912根据Box-Behnken设计原理，结合单因素试验结果，以培养温度、培养基pH值和接种量为因素，设计3水平的响应面试验。由Design Expert 10软件对结果进行分析，得到最大响应值。纤维素降解菌培养条件的响应面试验因素与水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T002表2纤维素降解菌培养条件的响应面试验因素与水平设计水平A培养温度/℃B 培养基pH值C接种量/mL-1356404076145881.2.4纤维素降解菌酶促反应条件的筛选对纤维素降解菌酶促反应条件进行单因素试验及响应面优化试验。选择反应温度、pH值和CMC-Na浓度3个因素对纤维素降解菌酶促反应影响进行单因素试验，试验进行3次重复。纤维素降解菌酶促反应条件的因素与水平设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T003表3纤维素降解菌酶促反应条件的单因素水平设计水平A温度/℃B pH值C CMC-Na浓度/%130542356634078445810550912根据响应面Box-Behnken设计原理，结合单因素试验，以反应温度、pH值和CMC-Na浓度3个因素设计3个水平的响应面试验。由Design Expert 10软件对结果进行分析，得到最大响应值。纤维素降解菌酶促反应条件的响应面单因素水平设计见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T004表4纤维素降解菌酶促反应条件的响应面试验因素与水平设计水平A温度/℃B pH值C CMC-Na浓度/%-1504.410605.21.51706.021.2.5葡萄糖标准曲线的绘制用10 g/L的葡萄糖标准溶液配制0.1~0.5 g/L的葡萄糖溶液，以不含葡萄糖溶液的样品为空白对照，取不同浓度的葡萄糖溶液各2 mL，分别加入6支试管中，依次加入2 mL蒸馏水和5 mL DNS溶液，将上述溶液混合均匀后于沸水浴中煮沸5 min，冷却至室温，混匀，在540 nm波长处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量为横坐标，绘制标准曲线。得到葡萄糖标准曲线为y=2.400 7x-0.237 1，R2=0.998 6。1.2.6酶活力测定将含1% CMC-Na的0.05 mol/L柠檬酸缓冲液（0.05 mol/L柠檬酸钠54 mL、0.05 mol/L柠檬酸46 mL、CMC-Na 1 g、pH值为4.8）作为底物测定酶活力。用分光光度计测定OD540 nm值。所得值与葡萄糖标准曲线进行比较。酶活力/(U/mL)=(AE-AD)+CK×V×t×1 000(2)式中：AE为酶反应液的吸光度值；AD为空白对照的吸光度值；C为标准曲线的截距；K为标准曲线的斜率；V为底物溶液的体积（mL）；t为酶解反应时间（min）；1 000为转化因子（1 mmol=1 000 μmol）。2结果与分析2.1纤维素降解菌CE41的酶学特性分析（见图1）图1纤维素降解菌CE41的酶学特性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F1a1（a）温度对CE41纤维素酶相对酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F1a2（b）pH值对CE41纤维素酶相对酶活力的影响由图1（a）可知，纤维素酶活力随着培养温度的升高快速下降。当温度为45 ℃时测得纤维素酶活力最强，代表该温度下CE41产酶量最多、生长速度最快。由图1（b）可知，随着培养pH值的升高，CE41的纤维素酶活出现先上升后下降的趋势。pH值在6~9时，相对酶活力只下降了20%左右。pH值为7时，CE41的纤维素酶活力达到最高。研究表明，该菌具有一定的耐酸碱能力，其适宜生长温度在45 ℃左右。2.2纤维素降解菌培养条件的单因素试验结果2.2.1培养温度对纤维素酶活力的影响（见图2）由图2可知，随着温度的升高，相对酶活力呈先增加后降低的趋势。温度为40 ℃左右时，酶活力达到峰值，表明该温度下CE41的产酶量最多、生长速度最快。40 ℃之后纤维素酶的相对酶活力直线下降。因此，把35~45 ℃作为后续优化的温度区间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F002图2培养温度对纤维素酶活力的影响2.2.2培养pH值对纤维素酶活力的影响（见图3）由图3可知，随着pH值的升高，相对酶活力呈先增加后降低的趋势。pH值为7左右时，酶活力达到峰值，此pH值下CE41的产酶量最多、生长速度最快。随着pH值继续升高，纤维素酶活力呈现急剧下降趋势。因此，选择pH值为6~8进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F003图3培养pH值对纤维素酶活力的影响2.2.3接种量对纤维素酶活力的影响（见图4）由图4可知，接种量在4~12 mL的范围内随着接种量的增加，相对酶活力呈先上升后下降的态势，在接种量6 mL左右时酶活力达到峰值。因此，选择提取接种量的4~8 mL进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F004图4接种量对纤维素酶活力的影响2.2.4纤维素降解菌培养条件响应面优化及验证结果纤维素降解菌培养条件的响应面试验结果见表5。由表5可知，CE41的培养条件的二次多项回归方程为：Y=27.44-1.2A-0.62B+0.58C+0.012AB+0.035AC-1.07BC-4.51A2-4.93B2-4.8C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T005表5纤维素降解菌培养条件的响应面试验结果编号ABC酶活力/(U/mL)1-1-1019.538 521-1017.764 83-11018.189 8411016.463 35-10-119.150 2610-116.017 37-10120.150 2810117.156 690-1-116.584 01001-117.575 8110-1119.953 11201116.678 51300027.919 21400027.263 21500026.271 41600028.081 91700027.641 1纤维素降解菌培养条件的方差分析见表6。由表6可知，模型的P值小于0.000 1，具有极显著性，失拟项的P值为0.662 5，大于0.050 0，无显著相关性，说明该模型的预测结果与试验数据相吻合。相关系数R2=0.991 4，说明模型的可信度高，拟合良好。3个因素之间存在交互作用，A、B、C、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，表明培养温度、pH值和接种量对纤维素降解菌CE41的酶产生量具有较大的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T006表6纤维素降解菌培养条件的方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型340.75937.8689.190.000 1A11.58111.5827.290.001 2B3.0413.047.160.031 7C2.6612.666.260.040 9AB5.58×10-415.58×10-41.31×10-30.972 1AC4.85×10-314.85×10-30.010.917 8BC4.5514.5510.720.013 6A285.75185.75201.980.000 1B2102.481102.48241.400.000 1C297.17197.17228.900.000 1残差2.9770.42失拟项0.8930.300.570.662 5误差项2.0840.52总和343.7216注：P0.05表示影响显著；下表同。纤维素降解菌培养条件试验的响应曲面图和等高线图见图5。图5纤维素降解菌培养条件试验的响应曲面和等高线图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F5a1（a）pH值和温度的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F5a2（b）接种量和温度的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F5a3（c）接种量和pH值的交互作用由图5可知，响应面曲线越陡，其对结果的影响越大，越平缓影响越小，再根据与F值的比较发现，培养温度A对纤维素酶活力Y的影响最大，其次是pH值B，接种量C的影响最弱。两个单因素之间的交互影响需要以等高线图中曲线斜率评价，斜率越小，交互影响越小；曲线斜率越大，交互影响越大。结合P值分析可以发现，AB、AC交互作用不显著，BC的交互作用显著。根据Design Expert 10软件预测得到纤维素降解菌CE41的最佳培养条件为：温度38.67 ℃、pH值6.93、接种量6.14 mL，此时酶活力最高，为27.556 U/mL。在该条件下进行3次重复试验，测得酶活力的平均值为27.725 U/mL，与预测结果无显著差异，说明该模型的准确性和可信度较高。2.3纤维素降解菌酶促反应条件的单因素分析2.3.1反应温度对纤维素酶活力的影响（见图6）由图6可知，相对酶活力在30~70 ℃时呈先上升后下降的态势，60 ℃左右时，酶活力达到峰值，酶促反应最剧烈。因此，选定50~70 ℃进行后续优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F006图6反应温度对纤维素酶活力的影响2.3.2缓冲液pH值对纤维素酶活力的影响（见图7）由图7可知，当pH值小于5.2时，相对酶活力随pH值升高而增加；在pH值为5.2左右时酶活力达到峰值，酶促反应最剧烈；pH值大于5.2后，纤维素酶活力呈现明显下降趋势。因此，进行后续优化试验的柠檬酸盐缓冲液的pH值范围选定在4.4~6.0。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F007图7缓冲液pH值对纤维素酶活力的影响2.3.3CMC-Na浓度对纤维素酶活力的影响（见图8）由图8可知，CMC-Na浓度在0.5%~2.5%的范围内酶活力先增加后降低，在浓度为1.5%左右时酶活力达到峰值，酶促反应最剧烈。因此，选取1%~2%的CMC-Na浓度进行后续优化试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F008图8CMC-Na浓度对纤维素酶活力的影响2.3.4纤维素降解菌酶促反应条件响应面优化及结果验证纤维素降解菌酶促反应的响应面试验结果见表7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T007表7纤维素降解菌酶促反应的响应面试验结果编号ABC酶活力/(U/mL)1-1-1022.094 221-1019.719 63-11019.640 2411016.626 05-10-122.765 9610-118.779 77-10121.679 6810117.958 990-1-123.364 11001-120.634 1110-1119.344 31201119.294 51300027.452 21400027.955 91500027.638 41600027.887 71700029.635 2由表7可知，纤维素酶促反应条件的二次多项回归方程为：Y=28.11-1.64A-1.04B-0.91C-0.16AB+0.066AC+0.67BC-4.48A2-4.12B2-3.34C2。纤维素降解菌酶促反应的方差分析见表8。由表8可知，模型P值小于0.000 1，具有极显著性，失拟项的P值为0.374 4，大于0.050 0，无显著相关性，说明该模型的预测结果与试验数据相符。相关系数R2=0.991 4，说明模型有较高的可信度，且拟合良好。各因素之间存在交互作用，A、B、C、BC、A2、B2、C2的P值均小于0.05，表明反应温度、pH值和CMC-Na浓度对纤维素酶酶活力具有较大的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.T008表8纤维素降解菌酶促反应的方差分析项目平方和自由度均方F值P值模型264.700929.41033.350.000 1A21.440121.44024.310.001 7B8.67018.6709.830.016 5C6.60016.6007.480.029 1AB0.10010.1000.120.743 5AC0.01810.0180.020.891 6BC1.80011.8002.040.196 6A284.450184.45095.760.000 1B271.310171.31080.860.000 1C246.950146.95053.240.000 2残差6.17070.880失拟项3.12031.0401.360.374 4误差项3.05040.760总和270.88016纤维素降解菌酶促反应条件试验的响应曲面图和等高线图见图9。反应温度A对纤维素酶活力的影响最大，其次是pH值B，CMC-Na浓度C的影响最弱。分析可以发现，AB、AC、BC的交互作用均不显著。图9纤维素降解菌酶促反应条件试验的响应曲面和等高线图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F9a1（a）pH值和温度的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F9a2（b）CMC-Na浓度和温度的交互作用10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.011.F9a3（c）CMC-Na浓度和pH值的交互作用根据Design Expert 10软件预测得到纤维素酶酶促反应条件为温度58.19 ℃、pH值5.09、CMC-Na浓度1.42%，此时酶活最高，为28.402 U/mL。在该条件下进行3次重复试验，测得酶活的平均值为29.284 U/mL，与预测结果基本吻合，说明预测模型的准确性和可信度较高。3讨论响应面法是一项被广泛应用的、技术成熟的科学方法。Mustefa等[7]使用响应面法优化从曲霉菌中生产碱性蛋白酶的工艺，从温度、pH值和蔗糖浓度3个方面进行优化；Senthivelan等[8]使用响应面法优化从Penicillium chrysogenum中筛选和生产漆酶的技术，传统工艺得到的漆酶酶活力为6.0 U/mL，优化后达到7.9 U/mL；Udume等[9]使用响应面法优化降解水葫芦木质纤维素工艺，优化后的工艺大大加速了木质纤维素的降解速度。本研究使用响应面法对纤维素降解菌CE41的培养条件和纤维素酶酶促反应条件进行优化，极大提升了CE41的生产能力和纤维素酶的酶活力。纤维素是自然界中储量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源[10]。纤维在动物饲料中广泛存在，但是纤维素的存在使多种非常规原料在动物生产中的应用受到限制[11-12]。本文优化结果增加了CE41在实际生产中应用的前景，尤其是在饲料行业，可以作为添加剂改善饲料营养配比，进而提高养殖的经济效益[13-14]。纤维素酶是全球商业市场中高度需求的工业酶，在不同工业领域具有广泛的实用性[15-16]。本文优化了纤维素酶酶促反应条件，优化后的纤维素酶酶促反应条件极大地提高了酶活力，可以明显促进纤维素酶将纤维转化成有机质，增加了CE41在工业领域的应用前景。4结论通过单因素试验与响应面分析，得到纤维素降解菌CE41最优的培养条件为温度38.67 ℃、pH值6.93、接种量6.14 mL，此时酶活力最高为27.556 U/mL。CE41纤维素酶最佳酶促反应条件为反应温度58.19 ℃、pH值5.09、CMC-Na浓度1.42%，此时酶活力最高为28.402 U/mL。本研究为纤维素的研究和利用提供依据。