在畜禽生产中使用抗生素或化学药物会造成药物残留、动物源细菌耐药等问题，从而威胁公共卫生安全[1-2]。中草药具有低毒性、低残留、安全、绿色等优点，可作为抗生素替代品在动物生产中应用。散剂型中草药添加剂具有较高的性价比，在畜禽养殖业中应用较多。但中草药的活性成分大多包裹在结构紧密的植物细胞壁内[3-4]，存在起效较慢、作用效果低等缺点。中草药发酵可以利用微生物代谢产生的酶类裂解中草药细胞壁纤维，促进中药活性成分向胞外释放游离，从而提高中药活性成分的提取率和利用率，增强中药药效[5-6]。侧耳菌是一种常用的食药同源真菌，降解木质素、纤维素等植物纤维的能力较强，具有生长繁殖能力强、营养物质要求低、易于培养等优点，可在中草药、农作物等木质纤维素含量高的植物降解中广泛应用[7-8]。陈丽艳等[9]应用侧耳菌发酵黄芪，发现黄芪的活性成分可以得到充分释放，活性成分发生了生物转化，从而增强了黄芪的临床应用效果。本课题组从自然环境中分离筛选了一株高产漆酶、纤维素酶等活性的糙皮侧耳菌[10]，利用该菌对自拟中药方剂进行发酵，在已筛选发酵中药基质的基础上，对糙皮侧耳菌固态发酵复方中药的工艺进行了筛选优化，旨在为发酵中药的产业化生产提供一定参考。1材料与方法1.1材料与仪器1.1.1中药材与试剂黄芪、甘草、白术、蒲公英由哈尔滨绿达生动物药业有限公司提供。绿豆购自齐齐哈尔某粮油超市。碳酸钙、冰乙酸、无水乙酸钠、三氯乙酸等试剂，均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，2, 2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑-6-磺酸（ABTS）购自上海源叶生物科技有限公司。1.1.2菌种与培养基糙皮侧耳菌株HXS-M1由黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院微生物研究室分离并保存。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、纯净水1 000 mL，pH值自然。马铃薯葡萄糖液体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、纯净水1 000 mL，pH值自然。中药固态发酵基质（以重量计）：复方中草药粉30%（黄芪∶甘草∶白术∶蒲公英=1∶1∶1∶1）、绿豆粉10%、CaCO3 0.5%、水59.5%。1.1.3主要仪器设备DFY-500型高速多功能粉碎机（温岭市林大机械有限公司），ME104型电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），PHM-53型全自动高压蒸汽灭菌器（上海尧勋智能科技有限公司），Scb-1360型双人垂直超净工作台（无锡一净净化设备有限公司），DHP-9162型电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司），721N可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司），HZQ-F100恒温振荡培养箱（北京东联哈尔仪器制造有限公司），LXJ-IIB低速离心机（上海安亭科学仪器厂）。1.2测定指标及方法1.2.1菌种制备取活化的糙皮侧耳菌接种于PDA平板，置于28 ℃培养箱培养7 d，使用直径9 mm的无菌打孔器在菌落边缘制取菌饼。取一块菌饼接种于100 mL马铃薯液体培养基，置于摇床上以28 ℃、120 r/min振荡培养，培养7 d，得到发酵复方中药的种子液。1.2.2酶活测定1.2.2.1粗酶液制备精确称取中草药固态发酵培养物0.5 g，加入10 mL蒸馏水，经25 ℃、120 r/min振荡浸提3 h，5 000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液[11]。制备的粗酶液置于4 ℃冰箱保存。1.2.2.2漆酶酶活测定参照赵翠敏等[12]和王福玲[13]的方法测定粗酶液的漆酶酶活。取粗酶液0.1 mL，加至1.7 mL pH值5.0的0.1 mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液中，混匀，加入0.5 mmol/L ABTS底物溶液0.2 mL，混匀，25 ℃，反应6 min，加入0.4 mol/L的三氯乙酸溶液0.5 mL终止反应，以蒸馏水代替粗酶液为对照，在波长420 nm处测定吸光度。在25 ℃、pH值5.0条件下，每分钟氧化1 μmol ABTS所需的酶量为1个酶活力单位（U）。1.2.3发酵工艺优化单因素试验取糙皮侧耳菌种种子液，按5%接种量接种复方中药固态发酵基质，搅拌均匀，置于28 ℃培养箱培养，分别培养至18、21、24、27、30 d取样，测定糙皮侧耳菌发酵中药基质中的漆酶活力，试验重复3次。取糙皮侧耳菌种种子液，分别按3%、5%、7%、9%、11%接种量接种复方中药固态发酵基质，搅拌均匀，置于28 ℃培养箱培养24 d，测定侧耳菌发酵中药基质中漆酶活力，试验重复3次。取糙皮侧耳菌种种子液，按5%接种量接种复方中药固态发酵基质，搅拌均匀，分别在24、26、28、30、32 ℃环境中培养，培养第24 d时取样，测定糙皮侧耳菌发酵中药基质中漆酶活力，试验重复3次。1.2.4响应面试验设计（见表1）在单因素试验基础上，应用响应面法中的Box-Behnken中心组合试验设计，分别选取发酵时间（A）、菌种接种量（B）、发酵温度（C）为考察对象，以发酵基质中漆酶活力为响应值，利用Design Expert 12.0软件设计3因素3水平试验，优化糙皮侧耳菌发酵工艺。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.T001表1响应面试验设计水平A发酵时间/dB菌种接种量/%C发酵温度/℃-1223260245281267301.2.5验证试验按优化的发酵工艺进行复方中药固态发酵，测定粗酶液中的漆酶活力，验证预测结果的准确性，试验重复3次。1.3数据统计与分析采用Excel 2010作图，SPSS 26.0软件处理试验数据，进行单因素方差分析，Duncan's法进行组间多重比较。应用Design Expert 12.0建立多元二次模型方程进行方差分析，作出响应面图和等高线图。应用数据优化程序计算Y最大值时，培养基成分优化值。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1发酵时间对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活性的影响（见图1）由图1可知，在发酵至第24 d的基质中漆酶活力最高，达到3 871.76 U/g，极显著高于其他发酵时间（P0.01）。因此，本试验条件选取糙皮侧耳菌固态发酵复方中药的发酵时间为24 d。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.F001图1发酵时间对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活性的影响注：不同大写字母表示差异极显著（P0.01），不同小写字母表示差异显著（P0.05）；下图同。2.1.2菌种接种量对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活性的影响（见图2）由图2可知，接种9%种子液的基质中漆酶活力最高，极显著高于接种3%种子液基质（P0.01）。因此，优选5%接种量为糙皮侧耳菌发酵复方中药的最佳接种量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.F002图2菌种接种量对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活性的影响2.1.3发酵温度对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活性的影响（见图3）由图3可知，发酵温度为28 ℃时，基质中漆酶活力最高，显著高于发酵温度为26 ℃的漆酶活力（P0.05），极显著高于在24、30、32 ℃环境发酵基质中的漆酶活力（P0.01）。因此，糙皮侧耳菌固态发酵复方中药的优选发酵温度为28 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.F003图3发酵温度对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活性的影响2.2响应面优化试验及方差分析结果（见表2、表3）根据Box-Behnken中心复合设计原理，以发酵时间（A）、菌种接种量（B）和发酵温度（C）为3个自变量，以漆酶活力（Y）为因变量设计了3因素3水平的响应面分析试验。采用Design Expert 12.0软件分别对漆酶活力（Y）优化试验结果进行多元回归拟合分析，得到回归模型为：Y=4 060.10+91.88A-35.00B-4.40C+17.45AB+43.68AC+17.67BC-126.82A2-170.54B2-161.83C2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.T002表2响应面优化试验结果试验号ABC漆酶活力1-1-103 745.2120004 200.0531-103 885.364-1103 605.1950113 745.43610-13 850.2770003 955.2380004 060.3690-113 744.98100004 094.87111013 885.061201-13 675.1213-1013 605.25140-1-13 745.3615-10-13 745.18160003 989.97171103 815.16U/g由表3可知，试验结果所选模型P值小于0.01，表明模型显著性极高。失拟项P值大于0.05，模型决定系数R2均在0.9以上，表明模型与试验情况拟合良好，可以用来分析和预测最佳产酶条件。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型4.23×10-5946 959.507.6200.007 0A67 531.80167 531.8010.9500.012 9B9 800.7019 800.701.5900.247 8C154.971154.970.0250.878 5AB1 218.7111 218.710.1980.670 0AC7 631.7717 631.771.2400.302 6BC1 249.2711 249.270.2030.666 2A²67 723.75167 723.7510.9800.012 9B²1.23×10-511.23×10-519.8600.002 9C²1.10×10-511.10×10-517.8900.003 9残差43 158.4276 165.49失拟项6 447.4732 149.160.2340.868 6纯误差36 710.9649 177.74总离差4.658×10-516注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。方差分析结果表明，发酵时间因素对漆酶活力影响P值小于0.05，表明发酵时间（A）对漆酶活力影响显著（P0.05）；而接种量（B）和发酵温度（C）对漆酶活力影响不显著。2.3各因素交互作用对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活力的影响（见图4）由图4可知，发酵时间和接种量因素交互作用对漆酶活力影响等高线图均趋近于圆形，表明两者交互作用对酶活力影响不显著（P0.05）。发酵时间与发酵温度及接种量与发酵温度的交互作用对酶活力影响均不显著（P0.05）。在发酵时间由22 d增加至26 d时，接种量由3.0%增加至7.0%，发酵温度由26 ℃增加至30 ℃，酶活力均呈先升高后下降的趋势，凸起顶点处即为响应优化最大值。图4各因素交互作用对糙皮侧耳菌HXS-M1固态发酵中草药产漆酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.F4a1（a）发酵时间和接种量对漆酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.F4a2（b）发酵时间和发酵温度对漆酶活力的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.15.019.F4a3（c）接种量和发酵温度对漆酶活力的影响2.4验证试验结果使用Expert Design 12.0软件分析得到复方中药最优固态发酵工艺为菌种接种量3.917%，发酵温度28.061 ℃，发酵时间24.724 d，预测值为4 078.095 U/g。为了验证试验方案的有效性，并考虑实际操作的便利，将最优发酵工艺条件调整为菌种接种量4.0%，发酵温度28.0 ℃，发酵时间25 d，在该条件下进行3次平行试验，试验结果分别为3 978.52、4 082.16、3 981.39 U/g，取平均值为4 014.02 U/g，与预测值4 078.095 U/g相近，表明优化结果可靠。3讨论利用微生物产生的相关活性酶对中草药进行发酵，可以消化中草药植物的纤维细胞壁，促进中药活性成分的溢出，从而提高中草药的生物利用度[14]。本研究使用复方中药是由黄芪、甘草、白术、蒲公英等食药同源中草药组成的方剂，糙皮侧耳菌是培育平菇的菌种，具有食药同源的双重作用，经过真菌与中草药发酵互作，能够促进中草药活性成分游离释放，转化中草药及真菌产生的多糖等活性成分，协同提高中草药与真菌的利用率，增强中草药的药效。传统中药发酵菌主要以真菌为主，真菌的代谢产物较为丰富，可以产生丰富的纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、脂酶等多种酶类，能够降解中草药植物纤维，促进中药活性成分的释放[15]。在降解植物纤维的酶系中，漆酶与锰依赖的过氧化物酶、木质素过氧化物酶均属于木质素酶，是降解植物纤维的主要酶类。要实现植物纤维的有效降解，需要先利用木质素酶降解木质素，然后才能暴露其包裹的纤维素，使裸露的纤维素在纤维素酶的作用下得以降解，因此漆酶等木质素酶类在植物秸秆的降解中发挥着关键作用[16]。因此，本研究利用高产漆酶活性的糙皮侧耳菌作为菌种进行中草药发酵，并选择糙皮侧耳菌产漆酶活性作为优化发酵工艺的考核指标，方法切实可行。在糙皮侧耳菌等白腐菌的生长代谢过程中，其产纤维素酶、漆酶等酶类的能力与碳源、氮源、矿物质、维生素等营养成分及培养温度、培养时间、培养方式等因素密切相关，这些因素能够影响菌株的产酶活性及降解植物木质纤维素的效率[17]。本研究菌株的产酶试验已经证实，糙皮侧耳菌具有较高的产漆酶和纤维素酶活性，其生长适宜温度范围为24~32 ℃，产酶高峰期在培养的第14~20 d之间，产酶活性与培养温度、培养时间、菌种接种量高度相关。本试验结果表明，优化的糙皮侧耳菌发酵工艺为菌种接种量4.0%、发酵温度28.0 ℃、发酵时间25 d。目前，在利用人工筛选菌种发酵中草药研究方面，其应用菌种主要是芽孢菌、乳酸菌等益生性菌，而利用真菌，尤其是食药真菌作为菌种发酵中药的研究较少。刘莹莹等[18]利用松乳菇发酵复方中药、王林等[19]利用灵芝菌发酵复方中草药，戴强[20]利用松乳菇发酵中药均取得了理想效果。4结论本研究以糙皮侧耳菌作为复方中药发酵菌种，以菌株的产漆酶活力为评价指标，应用单因素及响应面法试验，优化确定了复方中草药的固态发酵工艺为菌种接种量4.0%、发酵温度28.0 ℃、发酵时间25 d。在该优化工艺条件下，产漆酶活性达到4 014.02 U/g。