甘草具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抑菌等功效[1]。甘草提中的α-D-吡喃多糖称为甘草多糖（GUP），能够调节免疫，促进多种细胞因子形成与分泌，激活巨噬细胞和淋巴细胞等免疫细胞等[2]。硒分为无机硒和有机硒，无机硒毒性大、不易吸收。将更易吸收的有机硒与多糖化学合成可形成硒化多糖[3]，可以将硒元素与GUP合成硒化甘草多糖（SeGUP）。王丹阳等[4]报道，SeGUP能够提高免疫抑制小鼠体内免疫球蛋白G（IgG）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-2（IL-2）分泌含量。连科迅[5]研究发现，SeGUP、GUP能够通过显著提高免疫抑制小鼠免疫器官（胸腺、脾脏）指数、碳廓清指数、血清溶血素以及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、白细胞介素-4（IL-4）含量，提高免疫抑制小鼠免疫功能，SeGUP增强小鼠免疫功能效果优于GUP。丁艳等[6]研究发现，SeGUP能够缓解免疫应激状态下雏鸡的免疫功能，提高巨噬细胞吞噬指数、IL-2、TNF-α等细胞因子含量。关于SeGUP免疫调节方面的研究较少。本研究给小鼠注射环磷酰胺（CY），建立免疫抑制模型，通过小鼠灌服SeGUP，探讨SeGUP对免疫抑制小鼠的免疫调节功能，为SeGUP的临床应用以及进一步开发利用天然中草药作为免疫增强剂提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物96只昆明级小鼠，雌、雄各半，由新疆医科大学医学实验动物中心提供。1.1.2主要仪器Biotek SynergeyTM2多功能酶标仪购自美国伯腾仪器有限公司，DEAE-52层析柱、Sephadex G-100层析柱均购自北京博奥拓科技有限公司，冷冻干燥机购自北京松源华兴科技发展有限公司，高速冷冻离心机购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司。1.1.3主要试剂新疆乌拉尔甘草购自石河子市国浩中草药公司，葡聚糖G-100购自合肥博美生物科技有限责任公司，亚硒酸钠购自天津福晨化学试剂厂，透析袋、黄芪多糖（APS）均购自北京博奥拓科技有限公司，印度墨汁、CY、硝酸均购自上海源叶生物科技有限公司。IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG细胞因子试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。1.1.4GUP制备根据文献[7]中的方法，取干燥的新疆乌拉甘草1 000 g，工业乙醇浸泡12 h，除去脂质小分子。热水回流提取3次，加入无水乙醇使乙醇终浓度为80%，静置8 h，去除上清液，3 000 r/min离心15 min，取浓缩液，冷冻干燥得到新疆乌拉尔甘草粗多糖。将粗多糖配制成10 g/L溶液，使用氢氧化钠调pH值至7.0，加三氯乙酸搅拌4 h，加入过氧化氢，50 ℃水浴静置3 h。将处理过的溶液装入透析袋，蒸馏水透析72 h，置于层析柱除杂，离心除去沉淀，冷冻，干燥得到GUP。1.1.5SeGUP制备取500 mg GUP置于烧杯中，加入50 mL浓硝酸，在搅拌器上搅拌30 min，加入200 mg Na2SeO3，水浴8 h，加饱和无水碳酸钠，调节pH值至6.0，3 000 r/min离心15 min除沉淀，蒸馏水透析48 h，层析柱除杂，冷冻干燥得到SeGUP。1.2试验设计选取96只7~9周龄、体重（20±2）g昆明级小鼠适应性饲养7 d，随机分为6组，分别为空白组、模型组、阳性组、SeGUP高剂量组、SeGUP中剂量组、SeGUP低剂量组，每组16只小鼠。试验第1~3 d，除空白组外，其他组按体重腹腔注射环磷酰胺（CY）80 mg/g建立小鼠免疫抑制模型，每天称各组小鼠体重，小鼠体重表现不增加反降表明免疫抑制模型造模成功。试验第4~10 d，空白组、模型组腹腔注射0.3 mL的生理盐水，阳性组小鼠腹腔注射200 mg/g APS，SeGUP高、中、低剂量组小鼠分别腹腔注射300、200、100 mg/g SeGUP。1.3测定指标及方法1.3.1体重试验开始第1 d起，每天称量1次小鼠体重，观察其生长状态，持续10 d。1.3.2巨噬细胞吞噬指数试验第10 d，末次给药2 h后每组随机抽8只小鼠称重，随即尾静脉注射用生理盐水稀释4倍的印度墨汁0.01 mL/g，注射后的2、10 min分别从小鼠眼球内眦静脉丛取血20 µL，加入2 mL 0.1% Na2CO3，充分混匀，加入混合液200 µL至96孔板中，以0.1%的Na2CO3溶液作为空白，测定600 nm处的吸光度。颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠肝脏、脾脏，剥离其他组织以及脂肪，称重。计算碳粒廓清指数（K）、吞噬指数（α）。K=(lgOD1-lgOD2)/(t2-t1)(1)α=体重/(肝重+脾重)×K1/3 (2)式中：t1为间隔2 min，t2为间隔10 min，OD1为2 min所取血样的吸光度值，OD2为10 min所取血样的吸光度值。1.3.3IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG含量试验第10 d，末次给药2 h后每组剩余8只小鼠摘眼球采血，静置2 h，3 000 r/min离心15 min，-20 ℃保存。根据ELISA法检测血清中IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG含量，具体操作方法见试剂盒说明书。1.3.4免疫器官指数试验第10 d，每组8只小鼠采集血液后颈椎脱臼法处死，取胸腺、脾脏，剥离脂肪以及其他组织，称重，计算胸腺指数和脏器指数。脏器指数=脏器质量/体重(3)1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1SeGUP对小鼠体重的影响（见表1）由表1可知，与空白组相比，注射CY小鼠被毛凌乱无光泽，采食饮水、活动减少，模型组小鼠末重极显著降低（P0.01），表明免疫抑制模型造模成功。与SeGUP低剂量组相比，SeGUP高、中剂量组及阳性组小鼠末重均极显著升高（P0.01）。结果表明，添加高、中剂量SeGUP能够有效提高免疫抑制小鼠体重，其中SeGUP高剂量组提高小鼠体重效果优于阳性组，表明SeGUP高剂量对于提高小鼠体重具有较好的效果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.013.T001表1SeGUP对小鼠体重的影响组别初重末重空白组21.52±0.0824.54±0.17A模型组21.51±0.0319.32±0.17E阳性组21.53±0.0422.70±0.11CSeGUP高剂量组21.53±0.0222.93±0.17BSeGUP中剂量组21.49±0.0322.54±0.29CSeGUP低剂量组21.50±0.0221.16±0.13D注：同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。g2.2SeGUP对小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响（见表2）由表2可知，与空白组相比，其他组K、α指数均极显著降低（P0.01）；模型组小鼠K、α均极显著低于其他组（P0.01）；与SeGUP低剂量组相比，SeGUP高、中剂量组及阳性组小鼠K、α均极显著升高（P0.01）。结果表明，添加高、中剂量SeGUP能够有效提高小鼠K、α，其中提高α效果优于阳性组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.013.T002表2SeGUP对小鼠巨噬细胞吞噬指数影响组别Kα空白组0.032 5±0.002 1A6.288 8±0.069 9A模型组0.014 1±0.003 2D3.562 0±0.085 9F阳性组0.024 5±0.001 8B4.461 6±0.118 3DSeGUP高剂量组0.025 5±0.001 7B4.791 0±0.080 3BSeGUP中剂量组0.024 1±0.000 6B4.637 1±0.082 2CSeGUP低剂量组0.021 1±0.000 6C4.281 4±0.092 8E2.3SeGUP对小鼠血清中IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG的影响（见表3）由表3可知，与空白组相比，SeGUP高、中剂量组以及阳性组小鼠血清IL-2、IgM的含量极显著升高（P0.01），除模型组外其他组小鼠血清TNF-α、IFN-γ、IgG含量极显著升高（P0.01）。与模型组相比，其他组小鼠血清IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG的含量极显著升高（P0.01）。与SeGUP中剂量组、阳性组相比，SeGUP高剂量组小鼠血清IL-2含量极显著升高（P0.01）；与SeGUP低剂量组、空白组相比，SeGUP中剂量组、阳性组小鼠血清IL-2含量均极显著升高（P0.01）；阳性组以及SeGUP高、中剂量组小鼠血清TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG恶含量极显著高于SeGUP低剂量组、空白组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.013.T003表3SeGUP对小鼠血清中IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG的影响组别IL-2/(ng/L)TNF-α/(ng/L)IgM/(g/L)IFN-γ/(ng/L)IgG/(g/L)空白组235.693 8±4.534 3C427.266 3±10.715 4C0.841 6±0.018 2D327.145 0±4.788 7E5.277 6±0.070 2E模型组187.203 8±5.023 9D359.685 0±9.641 5D0.634 2±0.022 5E265.381 3±3.335 0F4.927 1±0.038 3F阳性组266.055 0±7.691 6B475.838 8±10.091 6A1.181 1±0.047 6A365.932 5±2.542 9A6.003 6±0.060 7ASeGUP高剂量组281.271 3±12.401 7A479.111 3±15.546 3A1.114 0±0.004 2B354.423 8±2.474 7B5.812 1±0.008 3BSeGUP中剂量组257.733 8±6.094 1B473.170 0±11.634 9AB0.984 6±0.005 9C346.593 8±1.071 5C5.737 6±0.017 7CSeGUP低剂量组244.216 2±9.034 4C458.217 5±13.488 7B0.813 9±0.008 3D336.682 5±1.700 0D5.636 4±0.020 5D结果表明，添加高、中剂量SeGUP能够有效提高免疫抑制小鼠血清中的IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG含量，从而提高细胞免疫、体液免疫功能，其中SeGUP高剂量组IL-2、TNF-α含量高于阳性组。2.4SeGUP对小鼠免疫器官指数的影响（见表4）由表4可知，与空白组相比，其他组小鼠胸腺指数均极显著降低，脾脏指数极显著升高（P0.01）；与模型组比较，其他组胸腺指数极显著升高、脾脏指数极显著降低（P0.01）；与阳性组和SeGUP低剂量组相比，SeGUP高、中剂量组小鼠胸腺指数较极显著升高（P0.01）。SeGUP高剂量组小鼠脾脏指数极显著低于SeGUP中、低剂量组（P0.01）。结果表明，添加高、中剂量SeGUP能够有效提高小鼠胸腺指数，添加高剂量SeGUP对改善造模后小鼠脾脏指数具有一定的效果，且效果均优于阳性组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.013.T004表4SeGUP对小鼠脾脏指数和胸腺指数的影响组别胸腺指数脾脏指数空白组2.178 8±0.100 7A3.842 5±1.078 3D模型组0.777 5±0.128 9D6.677 5±0.083 5A阳性组1.137 5±0.107 9C5.586 3±0.046 9BCSeGUP高剂量组1.478 8±0.072 8B5.129 0±0.095 0CSeGUP中剂量组1.397 5±0.045 3B5.775 0±0.209 0BSeGUP低剂量组1.235 0±0.057 3C5.985 0±0.095 0Bmg/g3讨论3.1SeGUP对免疫抑制小鼠体重的影响免疫抑制是由于免疫系统受到损害，导致机体对抗原的应答能力下降的一种免疫异常状态。CY是一种广谱活性物质细胞毒性物质，可以交叉链接DNA破坏DNA结构，导致DNA功能丧失或结合成4-羟基CY，促进免疫细胞凋亡，使机体处于免疫抑制的状态，常作为免疫抑制模型的药物[8]。本试验使用CY创建小鼠体内免疫抑制模型，模型组小鼠表现为体重减轻，吞噬功能、细胞因子分泌、免疫指数降低等表明造模成功[9-12]。本试验中，高、中剂量的SeGUP能够缓解免疫抑制小鼠体重的降低，能够在一定程度上恢复免疫抑制小鼠的免疫力。高剂量黄芪多糖、白花蛇舌草多糖能够增加肾癌荷瘤小鼠体质量[13]。太子参参须多糖能够显著提高免疫抑制小鼠的体重，呈现剂量依赖性，但未完全恢复到空白组体重[9]，与本试验结果相符。3.2SeGUP对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响巨噬细胞吞噬能力可反映机体非特异性能力，当病原菌等微生物进入机体，巨噬细胞可迅速吞噬、溶解异物，也可快速清理对机体自身产生的异物，同时还兼具抗原呈递功能，因此，吞噬能力指数也可反映其非特异性免疫功能[14]。许多研究表明，高剂量SeGUP[5]、黑枸杞多糖[14]、高剂量刺五加多糖[15]可显著提高免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力。硒化乳酸菌胞外多糖[16]能够增强巨噬细胞的吞噬能力以及分泌NO能力，提高促炎症因子IL-1、IL-6、IL-12、IFN-γ分泌。也有研究表明，高、中剂量硒化大蒜多糖可以提高小鼠巨噬细胞吞噬指数和吞噬率[17]。本试验结果表明，高、中剂量SeGUP可极显著提高免疫抑制小鼠K、α，从而提高小鼠非特异性免疫功能，对抗机体免疫力低下状态。3.3SeGUP对免疫抑制小鼠IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG的影响辅助性T细胞分化不足可以导致机体免疫失衡，机体最早进行免疫应答的细胞是巨噬细胞，当机体免疫系统受到侵害，天然免疫系统开始应答，巨噬细胞开始释放多种细胞因子，如TNF-α等[18]。TNF-α、IL-2主要参与细胞免疫，可促进T细胞的生长与成熟，刺激T细胞持续增殖，参与固有免疫。IL-2可提高NK、LAK、CTL等多种细胞的杀伤作用，在免疫系统中发挥重要作用[19]。TNF-α具有多种免疫活性，能够活化巨噬细胞，激活多种免疫细胞，增强炎性细胞吞噬能力，释放炎性介质，可以直接杀死病原菌。NK细胞可被IL-2激活，活化的NK细胞可分泌IFN-γ，IFN-γ可增加巨噬细胞杀伤以及吞噬细菌的能力，能够有效抵抗病原体以及病毒[20]。IgM是体液免疫过程中出现得最早的抗体，具有激活补体、强结合抗原的能力，从而调节机体免疫能力[6,21]。IgG是血液中含量最多的免疫球蛋白，在抗体介导的免疫保护中起到重要作用[21]。构树叶粗多糖能够通过提高IgG、IgM含量，进而改善免疫抑制小鼠的抗体水平，增强机体体液免疫能力[22]。本试验中，高、中剂量SeGUP能够有效提高CY造成免疫抑制状态的小鼠血清中IgM、IgG合成，提高小鼠体液免疫能力。也有研究表明，桔梗多糖[12]、SeGUP[4-5]能够提高CY免疫抑制小鼠的免疫器官指数，增强TNF-α、IL-2、IFN-γ、IgG的分泌，且呈剂量相关依赖性。本试验结果发现，高、中剂量SeGUP能够极显著提高小鼠血清IL-2、TNF-α、IgM、IFN-γ、IgG的分泌量，且呈剂量依赖关系，从而提高免疫抑制小鼠的细胞免疫、体液免疫效果。3.4SeGUP对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响胸腺、脾脏是机体主要免疫器官，免疫器官质量越大，表示机体免疫能力越强，抵抗力越强[10]。硒化党参多糖、党参多糖、桔梗多糖能够显著提高免疫抑制后小鼠的免疫器官指数，可逆转器官萎缩状态，且呈剂量依赖趋势，也可提高细胞因子以及抗体的分泌[11-12]。Guo等[23]发现，硒化多糖能够提高免疫抑制小鼠的免疫器官指数。Ren等[24]报道，大叶贯众多糖能够提高小鼠的免疫器官指数，且高、中剂量大叶贯众多糖能够增强淋巴细胞增殖活性从而调节免疫功能。Aipire等[25]指出，GUP能够促进小鼠淋巴细胞增殖，高水平的白细胞介素-12（IL-12）可能是促进细胞增殖原因，同时GUP能够提高血清中细胞因子分泌。硒化淫羊藿多糖、硒化板蓝根多糖能够明显提高肉鸡的免疫器官指数[26]。本试验利用CY造模，发现SeGUP高、中剂量组小鼠胸腺指数极显著高于SeGUP低剂量组，SeGUP高剂量组脾脏指数极显著低于SeGUP中、低剂量组；除空白组外，其他组小鼠脾脏指数极显著升高，与胸腺指数相反。原因可能是CY导致机体免疫力下降、脾脏代偿性增大以对抗机体不利环境，脾脏界限不清、脾结构消失，淋巴组织大量增生，自然杀伤性细胞活性显著升高，导致脾脏肿大增生。香菇多糖和黄芪多糖[27]、太子参参须多糖[9]治疗CY造模成功的小鼠，除空白组外，小鼠脾脏也出现代偿性增生，胸腺出现萎缩，与本试验结果一致。4结论本研究结果显示，与模型组相比，高、中剂量SeGUP对免疫抑制小鼠体重、巨噬细胞吞噬指数、细胞因子含量、免疫球蛋白含量、免疫器官指数的改善效果较好，对免疫抑制小鼠具有显著的免疫调节作用。