奶牛围产期是奶牛生理上的剧变时期，能量需要量急剧增加。但是，由于产犊应激和妊娠期瘤胃体积的压缩，采食量迟迟不能恢复，无法满足能量需要而出现能量负平衡现象（NEB）。在NEB状态下，奶牛的机体代谢发生变化[1]，影响奶牛对于营养物质的吸收与利用，最终导致奶牛生产性能下降[2]。NEB还会增加体脂动员，导致肝脏中非酯化脂肪酸（NEFA）蓄积，引起脂肪肝和酮病等营养代谢病[3-4]。近年来，研究人员不断寻求缓解围产期奶牛NEB的策略。甘露寡糖（MOS）是一种功能性寡糖，能够提高畜禽的生产性能[5]，有改善反刍动物免疫性能、缓解能量负平衡的潜力，但其作用机理尚不明确。在高产奶牛的研究中发现，MOS能够通过提高泌乳期奶牛瘤胃中纤维降解菌的相对丰度、促进纤维降解、提高瘤胃乙酸产量；还能通过降低乳酸产生菌丰度、提高乳酸利用菌丰度减少瘤胃的乳酸蓄积，稳定瘤胃pH值[6-7]。由于围产期日粮与高产奶牛的不同以及机体代谢活动的巨大差异，其瘤胃微生物区系与发酵模式与高产奶牛均有较大差异[8]。生产上也缺乏围产期奶牛MOS适宜添加剂量的研究。因此，试验研究在围产期奶牛饲粮中添加不同剂量MOS对围产期奶牛瘤胃发酵及瘤胃微生物菌群的影响。探索通过调控瘤胃代谢以缓解围产期奶牛NEB的途径，并尝试寻找围产期奶牛饲粮中添加的适宜浓度。1材料与方法1.1试验设计与试验动物取胎次（1.9±0.7）胎、体况评分3.43±0.24、上一泌乳周期产奶量及预产日期相近的干奶前期荷斯坦奶牛60头，按照随机区组试验设计方法，分为4组（C、L、M和H组），每组15头。C组奶牛饲喂基础饲粮，L、M和H组分别在基础饲粮基础上添加5、10和15 g/(头·d)MOS（奥特奇公司生产）。每天早上投料后，立刻将相应剂量的MOS撒在对应的奶牛饲料表面，确保添加的MOS被全部摄入。试验期为预产期前21 d至产后21 d停止饲喂。试验奶牛在产前饲喂围产前期饲粮，围产前期基础饲粮组成及营养水平见表1。每天分别于7：00和18：00饲喂2次。产后饲喂围产后期基础饲粮，围产后期基础饲粮组成及营养水平见表2。每天分别于6：30、14：30和19：30饲喂3次。试验期间自由饮水。产后1~7 d之内，每天分别于6：00和14：00挤奶2次；产后7~21 d之内，每天分别于6：00、14：00和19：00挤奶3次。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.T001表1围产前期基础饲粮组成及营养水平（干物质基础)原料组成含量/%营养水平合计100.00燕麦草25.50泌乳净能/(MJ/kg)5.59全株玉米青贮15.35粗蛋白质/%13.41羊草28.37粗脂肪/%3.92玉米酒糟4.00中性洗涤纤维/%46.4麸皮2.53酸性洗涤纤维/%26.32玉米3.45钙/%1.05甜菜颗粒6.50磷/%0.27豆粕5.70蒸汽压片玉米2.27棉粕3.47石粉0.35食盐0.25小苏打0.58氧化镁0.18预混料1.50注：1.每千克预混料含：VA 800 000 IU、VD3 180 000 IU、VE 7 000 mg、生物素45 mg、β-胡萝卜素300 mg、铜600 mg、铁1 000 mg、锰1 800 mg、钴20 mg、硒30 mg、碘39 mg；下表同。2.泌乳净能为计算值，其他营养水平均为实测值；下表同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.T002表2围产后期基础饲粮组成及营养水平（干物质基础)原料组成含量/%营养水平合计100.00全株玉米青贮24.00泌乳净能/(MJ/kg)6.68谷草10.00粗蛋白质/%16.07苜蓿干草16.00粗脂肪/%3.92玉米8.33中性洗涤纤维/%32.29蒸汽压片玉米12.18酸性洗涤纤维/%19.89豆粕9.46钙/%1.15膨化大豆3.99磷/%0.38全棉籽5.83菜粕1.70玉米酒糟1.72麸皮1.41甜菜颗粒2.55石粉0.35食盐0.21小苏打0.59氧化镁0.17预混料1.001.2瘤胃液的收集与检测每组随机选择5头奶牛，在产后21 d晨饲前通过口腔采集瘤胃液50 mL，立即测定pH值（DENVER UB-7型酸度计，美国）。瘤胃液经4层纱布过滤后分装于3个10 mL离心管中，第一份添加0.1 mL 6 mol/L HCl固氮，-20 ℃保存，用以测定微生物蛋白（MCP）；第二份低温离心机中10 000×g离心10 min，取3.0 mL上清液，加入0.3 mL偏磷酸，摇匀，静置30 min，10 000×g低温离心15 min，取上清，用以测定VFA；第三份置于纱布袋中，投入液氮罐内运回实验室，-80 ℃保存，以待用16S rDNA高通量测序分析技术检测瘤胃液微生物菌群。1.3测定指标及方法1.3.1瘤胃发酵指标的测定采用差速离心法和凯氏定氮法测定瘤胃液的MCP。计算公式如下：X=[(V1-V2)×N×0.014/(V×10/100)]×6.25×100%(1)式中：X为样品中蛋白质的百分含量；V1为样品消耗硫酸标准液的体积（mL）；V2为空白对照消耗硫酸标准液的体积（mL）；N为硫酸标准液的当量浓度；V为样品的体积（mL）。利用Agilent 7890A气相色谱检测仪采用外标分析法测定瘤胃液VFA。1.3.2瘤胃微生物菌群的测定采用SDS方法提取样本的基因组DNA，将稀释过的基因组DNA作为模板，选择16S V4区作为扩增区域，使用New England Biolabs公司的Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer以及高效保真酶，选择带Barcode的515F-806R作为特异性引物，用Qiagen公司提供的胶回收试剂盒回收目的条带。使用TruSeq® DNA PCR-Free Sample Preparation Kit试剂盒进行构建基因组文库。之后用Qubit和Q-PCR定量检测构建好的基因组文库，文库合格后，使用HiSeq2500 PE250进行上机测序。测序服务由北京诺禾致源生物信息科技有限公司提供。1.4数据统计与分析数据采用SAS 9.4的MIXED模型进行分析，用PDIFF校正的Tukey模型进行多重比较。用Contrast语句对NCG剂量的线性、二次和三次效应进行评估。结果以平均值和标准误差表示，采用Pearson方法对试验数据进行相关性分析。P0.05为组间差异显著，0.05P0.10为组间差异有趋势。2结果与分析2.1MOS对产后21 d奶牛瘤胃发酵指标的影响（见表3）由表3可知，随着MOS添加量的增加，奶牛产后21 d瘤胃液中微生物蛋白含量、总挥发性脂肪酸浓度、乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸的浓度和乙丙比均线性上升（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.T003表3MOS对产后21 d奶牛瘤胃发酵指标的影响项目MOS添加量/[g/(头·d)]SEMP值051015处理Trt线性L二次Q三次CpH值6.556.316.416.470.040.2340.6040.0840.318氨态氮/(mg/L)117.20113.20118.10115.405.700.9930.9850.9780.778微生物蛋白/(mg/L)311.00384.00411.00656.0041.100.0040.0010.1480.349总挥发性脂肪酸/(mmol/L)77.6082.9088.80102.002.800.0020.0010.2930.696乙酸/(mmol/L)42.2546.6449.2259.821.910.0010.0010.1960.390丙酸/(mmol/L)20.2821.7823.3024.340.680.1430.0240.8520.931丁酸/(mmol/L)2.242.282.523.120.340.0980.0300.2350.614异丁酸/(mmol/L)10.8110.4011.4712.600.100.0010.0010.0390.770乙丙比2.092.142.122.470.060.0380.0170.1260.3062.2MOS对产后21 d奶牛瘤胃微生物OTUs数量的影响（见图1）用Uparse软件对所有样本Tags进行聚类，以97%一致性聚类为OTUs。由图1可知，C、L、M和H组OTUs数分别为2 196、2 156、2 204和2 063，4组样本OTUs相似度较高，有1 741个OTUs为4组共有。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.F001图1奶牛瘤胃液菌群PICRUSt Venn图2.3MOS对产后21 d奶牛瘤胃微生物Alpha多样性的影响（见表4）由表4可知，各组样本间Alpha多样性指标均差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.T004表4MOS对产后21 d奶牛瘤胃微生物Alpha多样性的影响项目MOS添加量/[g/(头·d)]SEMP值051015TrtLQC覆盖率/%1.001.001.001.000.000.5470.1810.6610.844丰富度指数Chao11 646.011 648.571 597.521 609.9726.730.8940.5430.9320.653ACE1 650.981 665.801 608.771 611.0026.270.8510.4890.9120.607多样性指数Shannon7.527.607.317.540.140.9160.8650.8160.526Simpson0.960.970.970.970.000.9000.6040.8430.618PD whole tree80.5882.8278.2078.101.120.4140.2450.6070.2712.4MOS对产后21 d奶牛瘤胃菌群结构的影响（见表5、表6）由表5可知，4组样品共涉及11个门，各组相对丰度最高的菌群均为拟杆菌门（Bacteroidetes），此后依次是厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）。这3类菌占各组菌群相对丰度的90%以上。虽然MOS处理对大部分菌门均无显著影响，但是随着MOS添加量的增加，厚壁菌门和蓝藻菌门相对丰度呈线性下降（P0.01），纤维杆菌门具有二次上升趋势（P0.10），淋溶菌门（Elusimicrobia）相对丰度线性上升（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.T005表5MOS对产后21 d奶牛瘤胃微生物门水平菌群结构的影响项目MOS添加量/[g/(头·d)]SEMP值051015TrtLQC拟杆菌门46.4250.2348.6651.941.4630.6220.2840.9300.459厚壁菌门32.0529.2327.6826.480.7900.0580.0090.5660.929变形菌门17.1315.5017.2117.061.1080.9490.8900.7610.634软壁菌门1.341.481.501.380.1060.9520.8930.5830.994螺旋体门0.841.081.421.190.1270.4640.2350.3700.580纤维杆菌门0.660.781.320.710.1110.1210.4520.0920.104蓝藻菌门0.680.560.230.140.0650.0010.0000.8580.151髌骨细菌门0.430.520.540.510.0800.9660.7110.7320.990Kiritimatiellaeota0.160.330.250.270.0370.4420.4540.3320.281其他0.200.230.240.250.0180.7550.2970.8710.921放线菌门0.090.030.050.020.0140.3630.1660.6480.311淋溶菌门0.020.020.030.040.0030.0550.0120.2670.239%由表6可知，在丰度前10的属中，随着MOS添加量的提高，除毛螺菌属呈现线性下降的趋势（P0.10），纤维杆菌属呈现二次变化的趋势（P0.10）外，其余各属均无显著变化（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.T006表6MOS对产后21 d奶牛瘤胃微生物属水平菌群结构的影响项目MOS添加量/[g/(头·d)]SEMP值051015TrtLQC未注释普雷沃菌属19.218.017.718.61.2190.9790.8690.6980.990未注释毛螺菌属4.083.673.473.860.2500.8660.7150.4650.873未注释瘤胃球菌属4.083.604.203.990.2030.7720.8670.7550.333Shuttleworthia2.581.991.381.840.2090.2510.1340.2140.561未注释拟杆菌属1.091.771.602.010.2180.5280.2120.7530.482琥珀酸弧菌属1.091.060.920.650.1730.8290.3900.7560.992毛螺菌属1.110.910.690.620.1050.3730.0920.7600.850未注释蓝藻属0.500.050.890.010.1670.2030.6540.5090.049纤维杆菌属0.640.771.290.690.1100.1250.4610.0890.112小类杆菌属0.430.600.780.150.1450.5000.6140.1940.552%2.5部分瘤胃液菌群与MOS及瘤胃发酵指标的相关性（见表7）由表7可知，20个样品中检测到147个属，11个属与MOS添加量显著相关，8个属显著负相关，3个属显著正相关。11个属主要来自厚壁菌门（Firmicutes）（9/11），其余来自放线菌门（Actinobacteria）和淋溶菌门（Elusimicrobia）。瘤胃梭菌属1丰度的变化与瘤胃乙酸、异丁酸、总挥发性脂肪酸、微生物蛋白以及丁酸含量呈显著正相关。随着MOS添加量的升高，高夫罗瘤胃球菌属（Ruminococcus gauvreauii）、蒜头藻属（Allisonella）、溶纤维真杆菌属（Eubacterium cellulosolvens）、Shuttleworthia以及梭状芽孢杆菌属1（Lachnoclostridium 1）等菌属丰度下降 。其中，Allisonella、Lachnoclostridium 1与乙酸、丁酸以及TVFA含量显著负相关；Ruminococcus gauvreauii与乙酸、TVFA含量显著负相关，与丙酸含量极显著负相关；Shuttleworthia与乙酸、丁酸含量显著负相关，与TVFA含量极显著负相关。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.04.001.T007表7部分瘤胃液菌群与MOS及瘤胃发酵指标的相关性属甘露寡糖pH值微生物蛋白乙酸丙酸异丁酸丁酸总挥发性脂肪酸乙酸/丙酸蒜头藻属-0.523*0.092-0.248-0.570*-0.188-0.022-0.511*-0.512*-0.587**Anaerorhabdus furcosa group-0.515*0.079-0.539-0.312-0.278-0.442-0.407-0.3560.370依洛西姆菌属0.447*0.2470.497-0.556*-0.1380.113-0.580**-0.522*-0.465*溶纤维真杆菌属-0.465*-0.093-0.304-0.1710.0070.108-0.418-0.1180.063梭状芽孢杆菌属1-0.539*0.091-0.246-0.565*-0.046-0.109-0.487*-0.531*-0.030毛螺菌属FCS0200.445*0.0800.2040.4110.290-0.0230.484*0.3730.567*Pseudoscardovia-0.491*-0.024-0.335-0.251-0.173-0.029-0.161-0.223-0.098瘤胃梭菌属10.467*-0.0650.572*0.647**0.527*0.469*0.701**0.550*0.862**高夫罗瘤胃球菌属-0.539*0.501-0.242-0.482*-0.606**-0.412-0.408-0.500*-0.207Shuttleworthia-0.521*0.179-0.202-0.699*-0.374-0.249-0.682*-0.609**-0.790**未鉴定双歧杆菌属-0.496*0.161-0.406-0.251-0.1940.149-0.327-0.214-0.154注：*表示显著相关（P0.05），**表示极显著相关（P0.01）。3讨论本试验中，随着MOS添加量的增加，瘤胃液中微生物蛋白与乙酸的含量均显著升高。研究表明，饲粮中添加外源性MOS能够改善瘤胃发酵，提高瘤胃液微生物蛋白与乙酸的含量[9-10]。也有研究发现，MOS对于绵羊体外瘤胃发酵指标均未产生显著影响[11]。结果不同可能与所用饲粮结构不同有关。陈志龙等[12]研究发现，在绵羊体外瘤胃发酵中，MOS添加量与饲粮精粗比之间存在交互作用。本试验前期采用低能量水平饲粮，后期换用高能量水平饲粮，饲粮结构的变化会导致瘤胃微生物区系发生变化[13-14]。而MOS对于瘤胃发酵指标的影响则主要是通过调节瘤胃微生物区系而实现。本试验中，尽管微生物蛋白和瘤胃发酵指标出现显著变化，但瘤胃液菌群Alpha多样性无显著差异，与郭婷婷等[6]的研究结果一致，可能是因为MOS调控发酵主要是通过调节瘤胃液微生物的菌群结构而非多样性来实现的[15]。在不同能量水平下，MOS对于瘤胃微生物菌群相对丰度的影响不尽相同。MOS能够极显著降低高产奶牛瘤胃液中蓝藻门（Cyanobacteria）细菌的相对丰度，对厚壁菌门及纤维杆菌门丰度无显著影响[6]，但对于高精料诱导下的低乳脂奶牛而言，MOS对瘤胃液中蓝藻门细菌的相对丰度无显著影响，却显著提高厚壁菌门、纤维杆菌门细菌的丰度[7]。厚壁菌门与纤维杆菌门细菌是牛瘤胃中较为主要的菌群，可以产生大量纤维素酶[16]。研究表明，外源添加MOS能够提高奶牛瘤胃中纤维素降解菌的活性和数量[17]，有可能是通过提高厚壁菌门、纤维杆菌门细菌的相对丰度而实现的。本试验中，纤维降解菌的相对丰度随着外源性MOS添加量的提高而升高，从而提高对日粮的纤维降解率，与瘤胃中乙酸浓度的提高相一致。根据瘤胃液中出现显著变化的菌属与瘤胃发酵指标的相关性分析，MOS添加量与Ruminococcus gauvreauii、Allisonella、Eubacterium cellulosolvens、Shuttleworthia以及Lachnoclostridium 1等厚壁菌门菌属有较强的负相关性。Eubacterium cellulosolvens可以产生纤维素酶分解纤维素，然而其纤维素分解活性受到碳水化合物的抑制，这种效应被称为碳分解代谢抑制。Eubacterium cellulosolvens的许多菌种仅能利用纤维素或纤维二糖作为分解底物。当淀粉等可溶性碳水化合物含量较高时，其对于纤维素的分解能力会受到碳分解代谢抑制的影响[18]。本试验中，由于添加MOS，能够促进纤维素的分解，提高瘤胃液中碳水化合物的水平，因此，Eubacterium cellulosolvens与MOS添加量呈现显著负相关。动物消化道中的Ruminococcus gauvreauii、Shuttleworthia与Lachnoclostridium 1或许与疾病的发生有关。Ruminococcus gauvreauii是一种严格厌氧的革兰氏阳性球菌，在患糖尿病大鼠肠道中相对丰度显著提高[19]；在限制饮水的条件下，Shuttleworthia在绍兴鸭后肠道中的相对丰度显著上升[20]；而Lachnoclostridium 1则可作为标记物，用以诊断内源性大肠腺瘤和癌症的发生[21]。添加MOS降低了瘤胃液中Shuttleworthia与Lachnoclostridium 1的丰度，可能是因为MOS能够提高动物免疫性能[22]。瘤胃液中组胺含量过高会导致mTOR自噬通路受到抑制，清除有害物质的功能减弱，引起细胞损伤。组胺往往通过组氨酸脱羧形成，然而，Allisonella在不分解组氨酸的情况下也能够产生组胺。MOS降低Allisonella丰度，有利于减少组胺的产生，促进有害物质的清除。此外，MOS还可能通过增加Ruminiclostridium 1的相对丰度提高VFA的含量，因为该菌属与乙酸、异丁酸以及TVFA含量均有显著正相关性。纤维素在瘤胃内往往先被纤维分解菌分解为纤维二糖和纤维糊精，Ruminiclostridium 1是一种厌氧菌，其可以产生纤维二糖磷酸化酶以及纤维糊精磷酸化酶，进一步分解纤维二糖和纤维糊精[23]。4结论围产期饲粮中添加MOS虽然对瘤胃微生物的Alpha多样性影响不显著，但是显著提高瘤胃挥发性脂肪酸浓度、乙丙比和微生物蛋白水平，促进瘤胃发酵。相关性分析表明，MOS添加对瘤胃发酵的促进作用可能主要是通过调节菌群结构、促进纤维分解、降低疾病相关细菌丰度、改善瘤胃健康实现的。围产期奶牛日粮中MOS的最适添加量为15 g/(头·d)。