鹅具有肉味鲜美、脂肪少、瘦肉率高、胴体品质好、生长速度快等特点，是理想的高蛋白低脂肪食物[1]。鹅血是鹅加工的副产物，经常被直接丢弃或作为饲料。研究发现，鹅血中富含免疫球蛋白G（约530 mg/L）、超氧化物歧化酶（约390 U/mL）、谷胱甘肽（约4.5 mg/L）、转铁蛋白（约1 500 mg/L）、胸腺肽（约310 ng/L）、微量元素等，具有防癌、降压、辅助治疗糖尿病、促进早期胎儿脑神经细胞发育等作用[2-3]。因此，可以将鹅血制作成血粉，应用于动物生产中。杨远新等[4]使用发酵血粉代替豆粕饲喂育肥猪，发现试验Ⅱ组和试验Ⅲ组育肥猪的平均日增重分别比对照组提高了11.33%和14.34%。目前尚未见关于鹅血清粉对机体免疫活性的相关报道。因此，本研究以鹅血清为原料制作血清粉饲喂小鼠，通过测定免疫抑制小鼠体重、免疫器官指数、免疫器官指数等指标，探究鹅血清粉对小鼠的免疫活性及体能恢复影响，为探究鹅血清的免疫活性及其在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料昆明小鼠购自北京维塔河实验动物科技有限公司。环磷酰胺购自江苏盛迪医药有限公司。盐酸左旋咪唑片购自四川鼎尖动物药业有限责任公司。1.2鹅血清粉制备将健康鹅空腹12 h，颈部动脉无菌采血，4 ℃静置2 h，3 000 r/min离心20 min，收集上层血清，-20 ℃冷冻24 h，冷冻干燥，过100目筛。1.3试验设计选取体重（25±2）g的昆明小鼠72只，雌、雄各半，随机分为6组，每组3个重复，每个重复4只，除空白对照组外，其他各组小鼠于给药的第1~7 d皮下注射40 mg/kg环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型。空白对照组、阴性对照组小鼠每日灌胃0.01 mL/g生理盐水，阳性对照组小鼠每日灌胃20 mg/kg盐酸左旋咪唑，鹅血清粉高、中、低剂量组小鼠每日分别灌胃400、200、100 mg/kg鹅血清粉溶液，每天处理1次，连续10 d，试验结束前禁食12 h后采样[5]。小鼠饲喂啮齿类动物基础饲粮（江苏省协同医药生物工程有限责任公司），自由饮水，室温保持（26±1）℃，湿度50%~60%。1.4测定指标及方法1.4.1免疫抑制小鼠体重试验开始和结束当天，空腹测定各组小鼠的初重、末重，计算体重增长率。体重增长率=(末重-初重)/初重×100%(1)1.4.2免疫器官指数最后一次给药后，小鼠禁食12 h，72只小鼠全部使用颈椎脱臼法处死，开膛后在无菌条件下摘取胸腺和脾脏，去除周围结缔组织和脂肪称湿重，计算胸腺指数、脾脏指数。胸腺指数=胸腺重量/体重(2)脾脏指数=脾脏重量/体重(3)1.4.3血常规指标最后一次给药后，小鼠禁食12 h，每个重复选择2只小鼠，眼眶取血1.0 mL注入含有EDTA-K 2的抗凝管中，充分混匀，采用海力孚HF-3800全自动血细胞分析仪测定指标。血常规指标包括：红细胞（RBC）、白细胞（WBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）。1.4.4血清细胞因子和免疫球蛋白含量最后一次给药后，小鼠禁食12 h，每个重复选择2只小鼠，眼眶取血1.0 mL，低温静置2 h，3 000 r/min离心20 min，ELISA检测试剂盒（上海楚肽生物科技有限公司）测定血清细胞因子和免疫球蛋白含量。血清细胞因子和免疫球蛋白含量包括血清白细胞介素-2（IL-2）、干扰素-γ（IFN-γ）、免疫球蛋白G（IgG）。1.4.5脾脏乳酸脱氧酶（LDH）、酸性磷酸酶（ACPase）活性将取出的小鼠脾脏使用4 ℃预冷生理盐水冲洗干净，剪取适量组织，置于1.5 mL离心管中。按1∶9的比例加入组织样品和裂解液，放入钢珠，在冰浴条件下，使用球磨仪将脾脏组织研磨成匀浆，制备成10%脾组织匀浆液，3 000 r/min离心15 min取上清液，采用试剂盒（上海楚肽生物科技有限公司）测定脾脏LDH、ACPase活性[6]。LDH活性=(OD样品-OD对照)/(OD标准品-OD空白)×c标准蛋白浓度/c待测样品蛋白浓度 (4)式中：OD样品、OD对照为样品和对照在340 nm处吸光度值；c为蛋白浓度（mmol/L）。1.4.6负重游泳试验每个重复选择1只小鼠，在小鼠尾部束缚小鼠体重10%的重物，小鼠放入玻璃水缸中游泳，水深40 cm，水温（37±1）℃，以沉入水中10 s不能游出水面为体力耗竭，记录从开始放入水中至体力耗竭的时间，即游泳时间。1.4.7常压耐缺氧试验分别将小鼠置于底部有15 g钠石灰的500 mL的圆底烧瓶中，将瓶口密封，记录在正常气压下缺氧的生存时间。1.5数据统计与分析试验数据采用SAS软件进行分析，Duncan's法进行多重比较，Sigmaplot12.5作图。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1鹅血清粉对免疫抑制小鼠体重的影响（见表1）由表1可知，阴性对照组小鼠的体重增长率显著低于空白对照组（P0.05），表明本试验成功建立了免疫抑制小鼠模型。与空白对照组相比，其余5组小鼠的体重增长率均有不同程度的下降，其中各鹅血清粉处理组小鼠的体重增长率均显著高于阴性对照组（P0.05）。研究表明，鹅血清粉对环磷酰胺所致的体重增长率下降具有一定恢复作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.018.T001表1鹅血清粉对免疫抑制小鼠体重的影响组别初重/(g/只)末重/(g/只)体重增长率/%空白对照组27.62±1.1132.37±1.59a17.17±1.48a阴性对照组27.09±1.3728.63±1.33e5.70±1.05e阳性对照组27.68±1.2431.69±1.49b14.48±1.23b鹅血清粉低剂量组27.32±1.0329.42±1.08d7.70±1.05d鹅血清粉中剂量组27.45±1.1030.38±1.21c10.70±1.15c鹅血清粉高剂量组27.68±1.1231.43±1.46b13.52±1.09b注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2鹅血清粉对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响（见表2）由表2可知，阴性对照组小鼠的胸腺指数和脾脏指数显著低于空白对照组（P0.05），表明本试验成功建立了免疫抑制小鼠模型。各鹅血清处理组小鼠的胸腺指数和脾脏指数均显著高于阴性对照组（P0.05）。结果表明，鹅血清粉能够改善环磷酰胺所致的小鼠非特异免疫功能下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.018.T002表2鹅血清粉对免疫抑制小鼠免疫器官指数的影响组别胸腺指数脾脏指数空白对照组4.46±0.33a5.44±0.15a阴性对照组2.84±0.23c3.74±0.19c阳性对照组4.18±0.17a5.18±0.13a鹅血清粉低剂量组3.21±0.14b4.18±0.10b鹅血清粉中剂量组3.63±0.10b4.49±0.12b鹅血清粉高剂量组4.07±0.12a5.03±0.17amg/g2.3鹅血清粉对免疫抑制小鼠血常规的影响（见表3）由表3可知，与空白对照组相比，阴性对照组小鼠RBC、WBC、PLT和HGB均显著下降（P0.05），表明环磷酰胺可引起机体血液屏障的损害，降低免疫防御能力。与阴性对照组相比，鹅血清粉低剂量组小鼠RBC、PLT和HGB显著提升（P0.05），鹅血清粉中剂量组、鹅血清高剂量组小鼠RBC、WBC、PLT和HGB显著升高（P0.05）。HGB与RBC具有密切关联；WBC水平的变化是观察、诊断免疫能力低下疾病和急性感染性疾病的重要参考指标；PLT具有介导炎症反应、激活机体免疫系统、促进伤口愈合形成血栓的作用。结果表明，鹅血清粉能够改善环磷酰胺所致的小鼠免疫能力低下的血液指标。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.018.T003表3鹅血清粉对免疫抑制小鼠血常规的影响组别RBC/(×1012/L)WBC/(×109/L)HGB/(g/L)PLT/(×109/L)空白对照组8.94±0.26ab3.76±0.13a138.21±7.90a634.60±18.36a阴性对照组5.44±0.18d1.88±0.12c84.25±5.53c308.42±20.37e阳性对照组8.34±0.27b3.34±0.14a134.49±8.18a526.72±23.29b鹅血清粉低剂量组7.44±0.23c1.98±0.15c103.73±5.28b386.64±18.17d鹅血清粉中剂量组8.30±0.13b2.47±0.17b133.78±7.25a482.32±15.17c鹅血清粉高剂量组9.17±0.28a3.12±0.17a142.10±5.17a539.50±13.01b2.4鹅血清粉对免疫抑制小鼠免疫功能的影响（见表4）由表4可知，阴性对照组小鼠脾脏LDH、ACPase活性显著低于空白对照组（P0.05），表明模型建立成功，环磷酰胺可能会降低脾脏细胞活力，抑制脾脏细胞的防御功能，使脾脏细胞凋亡，导致免疫活性物质ACPase降低。各鹅血清粉处理组及阳性对照组的LDH活性显著高于阴性对照组（P0.05），鹅血清粉高剂量组及阳性组ACPase酶活性显著高于阴性对照组（P0.05）。结果表明，鹅血清粉可在一定程度上缓解环磷酰胺导致的小鼠脾脏中LDH、ACPase活性降低，激活巨噬细胞增强机体免疫，增强机体对外源性病原体的吞噬和细胞内降解能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.018.T004表4鹅血清粉对免疫抑制小鼠免疫功能的影响组别LDH/(U/g prot)ACPase/(U/g prot)IL-2/(ng/L)IFN-γ/(ng/L)IgG/(g/L)空白对照组1 286.22±71.29a12.20±0.39a261.81±14.66b27.24±1.51b14.31±0.43a阴性对照组918.54±39.65c8.69±0.70c164.48±5.20d20.15±1.97d8.35±0.95d阳性对照组1 264.90±60.58a10.97±1.02ab247.65±6.59b28.47±0.96b12.07±0.64b鹅血清粉低剂量组1 063.01±54.02b8.36±1.06c190.87±9.23c22.96±0.65c10.71±1.06c鹅血清粉中剂量组1 144.93±76.93b9.12±1.23bc241.57±10.23b28.16±1.19b11.32±0.59bc鹅血清粉高剂量组1 272.41±77.43a10.65±0.45b303.67±6.64a32.23±0.59a13.54±0.89b由表4可知，阴性对照组小鼠血清IL-2、IFN-γ、IgG含量均显著低于空白对照组，表明小鼠免疫功能低下模型建立成功。与阴性对照组相比，各鹅血清粉处理组及阳性对照组小鼠血清IL-2、IgG含量显著升高（P0.05），鹅血清粉中、高剂量组及阳性对照组小鼠血清IFN-γ含量显著提高（P0.05）。结果表明，鹅血清粉可显著改善环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠机体细胞因子含量，缓解环磷酰胺导致的免疫能力低下小鼠体内IgG含量降低，提高机体免疫活性。2.5鹅血清粉对免疫抑制小鼠负重游泳时间的影响（见图1）负重游泳是一种典型的耐力学试验，负重游泳的时间可直接反映机体的运动疲劳程度。由图1可知，环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的耐力显著下降，较对照组降低了约12 min（P0.05）。不同剂量鹅血清粉组小鼠的耐力呈剂量依赖性增加的趋势，其中鹅血清粉高剂量组小鼠的耐力与空白对照组相比差异不显著（P0.05）。结果表明，鹅血清粉能够明显延长环磷酰胺导致的免疫能力低下小鼠负重游泳时间，增强耐力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.018.F001图1鹅血清粉对免疫抑制小鼠负重游泳时间的影响注：“△”表示与空白对照组相比差异显著（P0.05）；“*”表示与阴性对照组相比差异显著（P0.05）；下图同。2.6鹅血清对免疫抑制小鼠常压性缺氧耐受性的影响（见图2）由图2可知，与阴性对照组相比，鹅血清粉组小鼠常压缺氧存活时间更长，且呈剂量依赖性。鹅血清粉高剂量组的小鼠耐缺氧水平（存活时间84 min）接近空白对照组（87 min），差异不显著（P0.05）。结果表明，鹅血清粉可显著延长环磷酰胺导致的免疫能力低下小鼠的常压耐缺氧的存活时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.12.018.F002图2鹅血清粉对免疫抑制小鼠常压缺氧存活时间的影响3讨论3.1鹅血清粉对环磷酰胺诱导血常规和小鼠免疫功能的影响血常规主要反映血液中各类细胞的数量、大小、比值及形态变化，对机体状况的评价及疾病的预后发展都具有重要意义。红细胞为血液中最多的细胞，具有运输和免疫功能[7]。白细胞是血液中无色有核血细胞的总称，其在动物机体损伤治愈、病原入侵抵御和疾病免疫应答等方面发挥重要功能[8]。在本研究中，鹅血清粉能够显著提高小鼠RBC、WBC、PLT和HGB。RBC能够促进T淋巴细胞依赖反应，增强巨噬细胞吞噬作用还能够识别清除体液循环中抗原-抗体免疫复合物[9]，表明鹅血清粉能够改善小鼠免疫能力。器官指数是反映机体器官功能的重要指标，其变化反映机体出现病变情况[10]。本研究结果表明，鹅血清粉能够提高小鼠免疫器官指数，说明鹅血清粉能够改善环磷酰胺所致的非特异免疫功能下降。LDH是参与葡萄糖糖酵解过程中所必需的酶，机体细胞糖酵解释放能量的速率与LDH的活性成正比。巨噬细胞吞噬作用所需的能量也来自糖酵解，LDH使乳酸含量升高，从而导致巨噬细胞胞内pH值下降，酸性环境有利于巨噬细胞胞内免疫活性物质和免疫功能的应答[11]。巨噬细胞为机体提供免疫防护，具有吞噬功能，可诱导细胞发生特异性免疫应答，参与免疫调节等[12]。ACPase与巨噬细胞的结合程度代表了巨噬细胞的激活程度[13]，且ACPase主要功能是转移磷酸基团和参与脂类代谢等[14]。巨噬细胞的活化能由ACPase活性的水平决定。当外界病原体入侵后，巨噬细胞能够立即发挥识别功能并迅速启动自身免疫应答机制快速吞噬病原体并且自身进行胞内裂解，以ACPase为主的溶菌酶是发挥胞内裂解的主要物质。本研究结果表明，鹅血清粉可在一定程度上促进ACPase酶活性加快胞内裂解，增加巨噬细胞数量进而增强免疫。IL-2是重要的免疫检测指标，具有多种免疫作用[15]。IFN-γ可激活巨噬细胞、细胞毒性T细胞和清除胞内病原体[16]。本试验通过测定IFN-γ发现，鹅血清粉可通过调节IFN-γ含量激活巨噬细胞调节免疫应答反应，表明鹅血清粉对IFN-γ参与的免疫应答反应具有正调控作用。研究发现，IL-2还具有活化和扩增Treg细胞、维持细胞稳态的作用，而给予鹅血清粉能够抑制环磷酰胺所致的小鼠血清IL-2含量减少[17]。IgG与抗原的亲和能力高，导致其更易参与组织和体表的防御作用，且分布广泛[18]。有研究表明，鹅血清粉可缓解环磷酰胺导致的免疫能力低下小鼠体内IgG含量降低[19]。3.2鹅血清粉对环磷酰胺诱导小鼠体重和体质能的影响体重增长率能直接或间接反映出机体健康状况。小鼠体重增长率的下降也是免疫能力低下模型造模成功的标志[20-21]。本试验中，各处理组小鼠的初重差异不显著，末重、体重增长率变化差异显著，与阴性对照组相比，鹅血清粉低、中、高剂量组的小鼠体重增长率有不同幅度增长，且均高于阴性对照组，表明鹅血清粉对环磷酰胺所导致的体重下降具有一定的恢复作用，改善免疫能力低下引起的体重下降。运动会增强机体的物质代谢水平，当过度运动时会破坏机体内稳态化平衡环境，从而产生疲劳[22]。当机体免疫能力降低时，机体抗疲劳能力下降，运动耐力降低，运动性力竭的时间显著缩短[23-24]。氧是维持机体代谢能力和生命活动所必需的物质，当机体遭受缺氧应激时会产生一系列的特异性全身反应，进而导致心绞痛、心律失常及心功能降低等一系列症状，免疫低下人群对缺氧性应激尤为敏感[25-26]。本研究结果表明，鹅血清粉可显著延长环磷酰胺导致的免疫能力低下小鼠负重游泳时间和常压耐氧的存活时间，增强免疫抑制小鼠的耐力。4结论本研究结果表明，鹅血清粉对小鼠胸腺指数和脾脏指数具有显著的促进作用，可显著抑制免疫低下小鼠的促炎免疫因子的分泌，提高小鼠机体IgG含量，明显延长免疫低下小鼠的负重游泳时间和常压耐缺氧存活时间，改善免疫低下小鼠的耐力。