嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）为乳杆菌属，是人和动物肠道中的重要益生菌，具有改善动物肠道微生态平衡、抑制病原菌、增强免疫力及促进生长等作用，常被作为生产生物饲料、微生态制剂的菌种[1-4]。但嗜酸乳杆菌菌体较脆弱，对贮藏条件要求较高，且耐温性、耐酸性均不佳，摄食后经过胃的强酸环境时极易失活，降低其在肠道内的活性[5-6]。研究表明，采用微胶囊技术能够对嗜酸乳杆菌可起较好的隔离防护效果，有效增强了嗜酸乳杆菌对消化道逆环境的抗性，充分发挥益生功效[7-10]。王珍珊等[11]研究发现，在日粮中添加4.0%嗜酸乳杆菌微胶囊制剂可提高肉羊的生长性能、屠宰性能和肉品质。嗜酸乳杆菌微胶囊技术是利用一些天然或合成的高分子成膜材料包埋嗜酸乳杆菌细胞，形成粒径为几毫米的微型胶囊。Nazzaro等[12]将嗜酸乳杆菌包埋于海藻酸钠-菊粉-黄原胶微胶囊中进行了模拟人工肠胃液试验，结果表明，菌体存活率及对胃酸的耐受性明显提高。刘媛等[13]利用改性海藻酸钠制备的乳酸菌微胶囊能够有效保护菌体免受胃酸损害，提高菌体存活率，加快菌体在肠液中的释放率。本研究以海藻酸钠（SA）和聚乙烯醇（PVA）为复合固定化载体，采用挤压法制备嗜酸乳杆菌微胶囊，通过响应面试验对微胶囊制备工艺进行优化，从而提高嗜酸乳杆菌在模拟胃液中的存活率，为嗜酸乳杆菌微胶囊工业化生产和产品开发提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus La4017）活菌数2.63×108 CFU/g，由甘肃省微生物资源开发利用重点实验室前期分离保藏。1.1.2培养基MRS液体培养基：葡萄糖20 g、无水乙酸钠5 g、酵母提取物5 g、MgSO4∙7H2O 0.58 g、柠檬酸二铵2 g、蛋白胨10 g、吐温-80 1 mL、K2HPO4∙7H2O 2 g、牛肉浸膏10 g、MnSO4∙4H2O 0.25 g，溶于1 000 mL去离子水中，调节pH值至6.3，121 ℃灭菌20 min。MRS固体培养基：在MRS液体培养基中添加1.5%~2.0%的琼脂粉。1.1.3主要试剂海藻酸钠（SA）（天津市百世化工有限公司），聚乙烯醇（PVA）（天津市凯通化学试剂有限公司），无水氯化钙（天津市北辰方正试剂厂），柠檬酸钠（天津市大茂化学试剂厂）。1.1.4仪器设备SW-CJ-2FD型超净工作台（苏静集团苏州安泰空气技术有限公司），SHH.W21.420型恒温水浴锅（北京科委永兴仪器有限公司），H2050R型冷冻高速离心机（长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司），LDZF-30L-I型立式高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），81-866型旋涡振荡器（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），IS-4T型恒温振荡器（苏州捷美电子有限公司），FE28型实验pH计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），JW.B5003型分析天平（宁波市纪铭称重设备有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌悬液制备使用MRS液体培养基将嗜酸乳杆菌活化，连续培养3代，将菌液在4 ℃、6 000 r/min离心10 min，弃去上清液，收集菌体沉淀，使用无菌生理盐水洗涤，重悬于无菌生理盐水中，配制成菌悬液，于4 ℃冰箱中保存，采用稀释涂布平板法对菌悬液进行活菌计数[14]。1.2.2微胶囊制备将3% SA和2% PVA加热溶解，与菌悬液以9∶1的体积比混匀，使用10 mL一次性医用注射器滴入CaCl2饱和溶液中，形成微胶囊，固定化一段时间，使用无菌生理盐水洗涤2次，于4 ℃冰箱中保存[15]。1.2.3嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率以5%柠檬酸钠溶液为解囊液，称取1.0 g嗜酸乳杆菌微胶囊，置于10 mL 5%柠檬酸钠溶液中，500 r/min振荡5 min进行解囊处理，将嗜酸乳杆菌微胶囊解囊，使菌体释放形成菌液。将菌液进行梯度稀释，吸取100 μL适宜稀释度的嗜酸乳杆菌菌液涂布于MRS固体培养基上，37 ℃条件下培养48 h后进行活菌计数，计算嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率[16]。包埋率=A/B×100%(1)式中：A为包埋后微胶囊中的活菌数；B为包埋前制备嗜酸乳杆菌微胶囊菌液的活菌数。1.2.4嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺单因素试验以包埋率为评价指标，在PVA质量分数为2.5%，固定化时间为2 h，对SA质量分数（2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%）进行单因素试验；在SA质量分数为3.0%，固定化时间为2 h条件下，对PVA质量分数（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）进行单因素试验；在SA质量分数为3.0%，PVA质量分数为2.5%条件下，对固定化时间（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h）进行单因素试验，确定各因素对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋效果的影响以及适宜范围。1.2.5嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺响应面优化试验依据单因素试验结果，以包埋率（Y）为响应值，SA质量分数（A）、PVA质量分数（B）、固定化时间（C）为因素，进行3因素3水平的响应面分析试验，确定最优的嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺，Box-Behnken试验因素与水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.T001表1Box-Behnken试验因素与水平设计水平A/%B/%C/h-12.52.01.503.02.52.013.53.02.51.2.6模拟胃液的配制及存活率测定模拟胃液：使用灭菌后的PBS缓冲溶液将胃蛋白酶（1∶10 000）配置成质量浓度为1 g/L的胃蛋白酶溶液，使用稀盐酸将pH值调节为3.0，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌。参考王森等[17]的方法进行模拟胃液中存活率的测定，称取1 g左右嗜酸乳杆菌微胶囊，加入9 mL模拟人工胃液中，37 ℃反应2 h，测定反应前后活菌数，计算微胶囊在模拟胃液中存活率。存活率=反应后的微胶囊菌数/反应前的微胶囊菌数×100%(2)1.3数据统计与分析试验数据采用SPSS 25.0软件进行显著性分析，Origin 2021软件进行作图，Design Expert8.0.6软件进行响应面试验分析。2结果与分析2.1嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺优化单因素试验结果2.1.1SA质量分数对微胶囊包埋率的影响（见图1）由图1可知，当SA质量分数小于3.0%时，微胶囊包埋率随着SA质量分数的增加而增加；当SA质量分数大于3.0%时，微胶囊包埋率随着SA质量分数的增加而减少。当SA质量分数在一个较低范围时，凝胶化反应速度随着SA质量分数提高而逐渐提升，形成的凝胶网结构逐渐紧密，因而能将更多的嗜酸乳杆菌固定在微胶囊中。SA质量分数继续增加，嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率呈下降趋势，原因可能是当SA质量分数超过一定范围时，SA水溶液黏度过高，菌体分散较为困难，且凝胶材料结合过于紧密，进而引起嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率降低。因此，确定SA质量分数为3.0%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F001图1SA质量分数对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率的影响2.1.2PVA质量分数对微胶囊包埋率的影响（见图2）由图2可知，嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率随PVA质量分数增加而变化，总体呈先增加后减小的趋势。当PVA质量分数为2.5%时，微胶囊包埋率最高，达到78.9%；原因可能是当PVA质量分数过低时，微胶囊成球性较弱，在SA反应体系中聚合效果差，形成的凝胶网结构不紧密，导致部分菌体溢出，因而微胶囊包埋率不高。而当PVA质量分数过高时，在SA与PVA的反应体系中，溶液过于黏稠，导致菌液与溶液混合不均匀，且微胶囊固定化操作不便，引起微胶囊包埋率下降。因此，确定PVA质量分数为2.5%进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F002图2PVA质量分数对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率的影响2.1.3固定化时间对微胶囊包埋率的影响（见图3）由图3可知，随着固定化时间增加，微胶囊包埋率也逐渐增加，当固定化时间为2 h时，微胶囊包埋率最高为80.4%。当固定化时间超过2 h时，嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率明显降低，表明SA与PVA在和CaCl2水溶液中化学交联时间延长会对嗜酸乳杆菌微胶囊中的细胞活力产生一定负面影响。微胶囊的形成是由于钙离子与钠离子置换而形成海藻酸钙，而置换需要一定时间，若固定化时间过短会造成离子置换不完全，形成的凝胶材料结合不够紧密，交联程度降低，可能会使部分菌体丢失，导致包埋率不高。但若固定化的时间过长会导致嗜酸乳杆菌微胶囊凝胶结构过于紧密，不利于菌体释放。因此，确定固定化时间为2 h进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F003图3固定化时间对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率的影响2.2响应面优化嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺结果2.2.1响应面试验结果（见表2）利用Design-Expert 8.0.6软件对表2进行二次多项方差分析，得到包埋率（Y）与SA质量分数（A）、PVA质量分数（B）、固定化时间（C）间的二次回归方程为：10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.T002表2响应面试验结果编号ABCY/%110177.8211074.131-1072.24-1-1070.45-11064.5601-159.8700085.58-10-171.1900087.51010-178.0110-1169.51200085.51300085.314-10176.6150-1-167.61600085.41701166.6Y=85.90+2.44A-1.84B+1.75C+1.95AB-1.43AC+1.22BC-2.80A2-12.80B2-7.22C2。2.2.2回归模型方差分析结果（见表3）由表3可知，嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺优化的二次响应面回归模型F值为75.84，P0.000 10.05，表明该模型显著（P0.05），且失拟项检验的F值为3.36，P值为0.136 10.05，说明失拟项对误差不显著（P0.05），进一步表明该模型可信度高，可利用该模型对嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺优化进行分析和预测。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.T003表3回归模型方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型1 146.489127.3975.840.000 1A47.53147.5328.300.001 1B27.01127.0116.080.005 1C24.50124.5014.590.006 5AB15.21115.219.060.019 7AC8.1218.124.840.043 8BC6.0016.003.570.100 6A233.01133.0119.650.003 0B2689.851689.85410.71＜0.000 1C2219.791219.79130.86＜0.000 1残差11.7671.68失拟项8.4232.813.360.136 1纯误差3.3440.84总误差1 158.2416注：P0.05表示影响显著；P0.01表示影响极显著。2.2.3各因素交互作用对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率的影响（见图4）由图4可知，SA质量分数与PVA质量分数对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率的交互作用显著（P0.05），表明这两个独立变量之间的变化对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率的影响并非简单的线性关系；在一定区域内，随着SA质量分数、PVA质量分数、固定化时间提高，嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率也相应提高；到达峰值后，由于各变量不断增长，嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率逐渐降低，表明各变量共同影响了嗜酸乳杆菌微胶囊的包埋率。图4各因素交互作用对嗜酸乳杆菌微胶囊包埋率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F4a1（a）SA质量分数和PVA质量分数对包埋率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F4a2（b）SA质量分数和固定时间对包埋率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F4a3（c）PVA质量分数和固定时间对包埋率的影响2.2.4验证试验通过回归模型分析，利用Design-Expert 8.0.6软件分析得到嗜酸乳杆菌微胶囊制备的最佳工艺条件，即SA质量分数3.04%、PVA质量分数2.47%、固定化时间2.05 h，微胶囊包埋率为86.22%。考虑到方便实际操作，将最佳工艺条件修改为SA质量分数3.0%、PVA质量分数2.5%、固定化时间2 h，采用此条件进行验证试验，重复3次，测得微胶囊平均包埋率为85.7%，与模型预测值基本相符，表明采用响应面优化法得到的嗜酸乳杆菌微胶囊最佳工艺参数可靠，具有一定的实用价值。2.2.5嗜酸乳杆菌微胶囊化显微镜检结果（见图5）由图5可知，微胶囊的形状主要为球形，并且互不粘连。油镜下可明显观察到微胶囊中固定的嗜酸乳杆菌，表明SA与PVA为复合固定化载体对嗜酸乳杆菌的包埋效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F005图5嗜酸乳杆菌微胶囊化显微镜检结果2.3微胶囊在模拟肠液中的释放情况（见图6）微胶囊在模拟人工肠液中的释放情况是评价微胶囊能否在动物肠道内定点释放的重要指标。由图6可知，嗜酸乳杆菌微胶囊能在肠液中缓慢释放，在120 min左右释放完全，表明复合材料制备的嗜酸乳杆菌微胶囊结构更加紧密，可延长其在模拟肠液中的裂解时间，从而使大量菌体定植于肠道内，同时有效地保护了被包埋的嗜酸乳杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.F006图 6在模拟肠液中微胶囊的释放情况2.4模拟胃液存活率测定结果将1 mL菌液和1 g微胶囊分别加入9 mL模拟人工胃液中，37 ℃反应2 h，测定其反应前后的活菌数，结果见表4。由表4可知，菌液中的菌数为2.63×108 CFU/g，经人工胃液反应后菌数为6.88×107 CFU/g，在模拟胃液中的存活率为26.2%。微胶囊中菌数为1.47×107 CFU/g，经人工胃液反应后菌数为1.03×107 CFU/g，在模拟胃液中的存活率可以达到70.1%，比未经微胶囊包埋的菌株存活率提高了167.6%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.13.014.T004表4微胶囊中包埋菌体在模拟胃液中的存活率项目反应前菌数/(CFU/g)反应后菌数/(CFU/g)胃液存活率/%菌液2.63×1086.88×10726.2微胶囊1.47×1071.03×10770.13结论本试验以SA和PVA为复合固定化载体，使其优劣势互补，并通过相应曲面法对嗜酸乳杆菌微胶囊制备工艺进行优化，确定嗜酸乳杆菌微胶囊包埋的最佳条件为SA质量分数3.0%、PVA质量分数为2.5%、固定化时间为2 h。此条件下微胶囊包埋率达85.7%，微胶囊包埋菌株在模拟胃液中2 h后的存活率达到了70.1%，比未经微胶囊包埋的菌株存活率提高了167.6%。研究提高了嗜酸乳杆菌在肠道中的存活率，可为嗜酸乳杆菌微胶囊工业化生产和产品开发提供了一定参考。