呕吐毒素（DON）是由镰刀菌产生的单端孢霉烯族化合物，通过结合核糖体的肽基转移酶位点破坏蛋白合成，可导致呕吐腹泻[1]。DON能够对小麦、玉米等作物及产品造成污染，严重影响产量及质量安全[2-3]。目前，针对DON的生物发酵降解脱除方法具有成本低、适应度高等优点[4-5]，是国内外研究的热点。固态菌剂作为微生物发酵降解脱毒的直投菌种，具有运输方便、易保藏、经济高效和操作简单的优点[6-7]。张家萌等[8]以豆粉、麦麸为载体通过40 ℃鼓风干燥法制备副干酪乳杆菌菌剂，活菌数与-50 ℃冷冻干燥法接近。李东歌等[9]对酿酒酵母通过36 ℃鼓风干燥，获得活菌率达71%的酿酒活性干酵母。安璟[10]通过55 ℃鼓风干燥法制得存活率为42%干酪乳杆菌菌粉，4 ℃保藏60 d后存活率为75%。德沃斯氏菌（Devosia sp.）为革兰氏阴性菌，不产生芽孢，对高温较敏感易失去活性，可高效降解DON，将DON转换为低毒物质。徐剑宏等[11]从麦穗和土壤样品中筛出DON降解菌DDS-1，经16S rDNA序列分析初步鉴定为德沃斯氏菌属。He等[12]从土壤中分离出一株DON降解菌Devosia mutans 17-2-E-8，经毒理学分析产物3-keto-DON、3-epi-DON毒性显著降低[13]。目前尚无关于DON降解菌德沃斯氏菌菌剂制备工艺的研究。本文以实验室筛得高效降解DON菌株德沃斯氏菌株D-8为研究对象[14]，基于单因素与正交试验确定发酵工艺参数，通过场发射扫描电镜（FESEM）观察微观结构，明确菌体与载体依附状态和最佳储藏条件，以期为DON降解菌剂的后期应用提供一定参考。1材料与方法1.1试验材料德沃斯氏菌株D-8由实验室前期筛得，于-80 ℃甘油管中保存。种子培养基：蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、糖蜜5 g/L，pH值7.2。固体平板培养基添加2%琼脂。发酵培养基：糖蜜25 g/L、酵母浸粉10 g/L、KH2PO4 2 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L，pH值7.2。载体材料：玉米蛋白粉、凹凸棒土、麦麸、玉米粉、豆饼粉、花生粕粉、玉米淀粉、明胶、β-环糊精、阿拉伯树胶及海藻酸钠。蛋白胨、酵母浸粉、NaCl、KH2PO4、琼脂、Na2HPO4·12H2O、明胶、β-环糊精、阿拉伯树胶及海藻酸钠购自国药集团化学试剂有限公司。糖蜜、玉米蛋白粉、凹凸棒土、麦麸、玉米粉、豆饼粉、花生粕粉及玉米淀粉购自源叶生物有限公司。1.2试验仪器HV-110灭菌锅（日本Hirayama公司）、PYL-125恒温培养箱（天津市莱玻特瑞公司）、GFL-70控温烘箱（天津市莱玻特瑞公司）、Multitron控温摇床（瑞士Infors公司）、LABCONCO TYPE生物安全柜（美国Labconco公司）、YC-015喷雾干燥机（上海雅程公司）、5810R冷冻离心机（德国Eppendorf公司）、14886真空包装机（得力公司）、Gemini 300场发射扫描电子显微镜（德国Zeiss公司）。1.3试验方法1.3.1菌株活化与培养从-80 ℃冰箱中取出甘油保存的德沃斯氏菌株D-8，平板划线活化，恒温30 ℃倒置培养3 d。挑取单菌落于一级种子培养基中，30 ℃、220 r/min振荡培养24 h，以5%接种量转接于二级种子培养基中，30 ℃、220 r/min培养24 h，以5%接种量转接于发酵培养基中培养。1.3.2生长曲线测定采用活菌数与OD600 nm值为生物量评价指标，每3 h检测发酵液活菌数与OD600 nm值至稳定期。菌液活菌数测定方法参考国标《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》（GB 4789.2—2016）[15]。1.3.3菌剂制备方法筛选1.3.3.1喷雾干燥法分别选择凹凸棒土、脱脂乳粉、可溶性淀粉、β-环糊精∶阿拉伯树胶为9∶1、明胶和海藻酸钠为喷雾干燥填料，添加质量分数分别为30%、30%、30%、30%、10%和2%，设置进风温度为100 ℃，其他条件不变，研究不同填料对干燥效果影响。向培养21 h的发酵液中添加质量分数为30%的脱脂乳粉，设置进风温度分别为80、100、120、140、160 ℃，蠕动泵进料速度为5 r/min，通针频率为8 s，风速为50 m3/h，研究不同进风温度对干燥效果影响。1.3.3.2鼓风干燥法培养21 h的发酵液4 000 r/min离心，浓缩2.5倍，以浓缩前1∶1质量比加入载体材料中，混合均匀，设置干燥温度为40 ℃，鼓风干燥至水分含量为14%。1.4鼓风干燥法菌剂制备工艺优化1.4.1载体种类对活菌数影响分别选用玉米粉、玉米淀粉、玉米蛋白粉、豆粕粉、花生粕粉、凹凸棒土、麦麸作为载体材料以1.3.3.2的方法制备菌剂，检测菌剂活菌数，筛选最优载体。1.4.2载体粒径对活菌数影响分别使用40、60、80、100目筛分离不同粒径玉米粉为载体材料，以1.3.3.2的方法制备菌剂，检测菌剂活菌数，筛选最优载体粒径。1.4.3温度对活菌数影响分别设置鼓风干燥温度为40、50、60、70、80 ℃，以1.3.3.2的方法制备菌剂并检测菌剂活菌数，筛选最优干燥温度。1.4.4菌液浓缩倍数对活菌数影响分别浓缩2.5、5.0、10.0、20.0、50.0倍发酵液与载体进行充分混合，以1.3.3.2的方法制备菌剂，并检测菌剂活菌数，筛选最优浓缩倍数。1.4.5菌剂水分含量对活菌数影响参考国标GB 1353—2018[16]质量指标中水分含量（≤14%）以1.3.3.2的方法分别制备水分含量在8%、10%、12%、14%的固态菌剂，检测菌剂活菌数，筛选最优水分含量。水分测定方法参考国标《食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）[17]。1.4.6正交试验设计由单因素试验筛选到对活菌数影响较大因素干燥温度（A）、发酵液浓缩倍数（B）和菌剂水分含量（C）进行3因素3水平正交试验，采用正交试验确定各因素最佳组合，正交试验因素及水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.T001表1正交因素及水平设计水平A干燥温度/℃B浓缩倍数C菌剂水分含量/%1402.5102505.01236010.0141.5菌剂微观分析利用场发射扫描电镜对菌剂微观表面形态特征进行观测，取少量样品置于导电胶样品台喷金处理，电压设置为3.00 kV，选择合适视野范围及放大倍数观测并拍照。1.6菌剂储藏条件以最佳菌剂制备工艺进行菌剂制备。分别设置储藏温度为4、25、37 ℃，真空与非真空储藏，储藏时长为30、60、90 d，检测活菌数，研究菌剂储藏稳定性。1.7数据统计与分析每组数据设置3组重复，试验数据采用SPSS 26.0软件分析，通过ANOVA进行差异显著性分析和方差分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1德沃斯氏菌D-8发酵生长曲线测定结果（见图1）由图1可知，随着发酵时间增加，德沃斯氏菌D-8活菌数快速增加，21 h时达到最大，为（13.84±0.72）lgCFU/mL，OD600 nm值达到（9.26±1.48）。此后吸光度继续增加，但活菌数不再增长。因此，发酵21 h时德沃斯氏菌D-8的活菌数达到最高值，可用于菌剂制备。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F001图1德沃斯氏菌发酵生长曲线2.2菌剂制备方法筛选2.2.1喷雾干燥制备德沃斯氏菌菌剂的活菌数（见图2）图2喷雾干燥制备德沃斯氏菌菌剂的活菌数注：不同字母表示差异显著（P0.05），图3~图7与此同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F2a1（a）填料种类对活菌数的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F2a2（b）进风温度对活菌数的影响喷雾干燥制备工艺具有制备周期短、生产过程简易、产品易溶解等特点。由图2（a）可知，进风温度为100 ℃时，以脱脂乳粉为填料活菌数达到（10.02±0.27）lgCFU/g，无法满足高活菌数要求，且脱脂乳粉价格昂贵不符合工业化需求。由图2（b）可知，随着进风温度的下降，活菌数少量增加，但随着进风温度进一步下降，菌剂出现挂壁现象，无法干燥完全。2.2.2鼓风干燥法测定结果鼓风干燥制备工艺具有过程简便、成本低廉、适应大规模生产的特点，与喷雾干燥法相比，鼓风干燥的温度较低，可避免高温对菌株造成损伤。设置相同料载体材料凹凸棒土及料液比，分别进行鼓风干燥与喷雾干燥。鼓风干燥制得菌剂活菌数为（10.41±0.32）lgCFU/g。喷雾干燥制得菌剂活菌数为（9.46±0.33）lgCFU/g，比鼓风干燥结果低一数量级，表明相同载体条件下高温是导致活菌数降低的重要原因。因此，选择低温鼓风干燥法进行菌剂制备，并优化鼓风干燥工艺参数。2.3鼓风干燥法优化制备工艺结果2.3.1载体种类对德沃斯氏菌D-8活菌数影响（见图3）由图3可知，当选取玉米粉作为载体材料时，德沃斯氏菌D-8活菌数可达（11.27±0.26）lgCFU/g，其次是淀粉作为载体材料。而凹凸棒土、小麦麸皮等其他材料作为载体材料时，德沃斯氏菌D-8活菌数均在10 lgCFU/g及以下。因此，玉米粉作为载体效果较好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F003图3不同载体对活菌数影响2.3.2载体粒径对德沃斯氏菌D-8活菌数影响（见图4）由图4可知，当载体粒径大于40目时，活菌数可以达到（11.41±0.05）lgCFU/g；随着粒径减少，菌剂活菌数随之下降，当粒径在40~80目时，德沃斯氏菌D-8菌剂活菌数均为（10.41±0.07）~（10.60±0.08）lgCFU/g；当粒径小于80目时，活菌数小于10 lgCFU/g，表明该菌株难以在较小粒径材料上附着存活。大于40目粒径玉米粉较少不足以开展后续试验及工业应用，因此选择40~80目载体进行菌剂制备。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F004图4粒径对活菌数影响2.3.3温度对德沃斯氏菌D-8活菌数影响（见图5）由图5可知，当干燥温度为40 ℃时，德沃斯氏菌D-8活菌数在（12.10±0.03）lgCFU/g；当干燥温度进一步提高至60、80 ℃时，活菌数下降较明显，分别为（7.23±0.06）lgCFU/g和4 lgCFU/g，表明高温环境对菌剂活菌数影响较大。因此，确定干燥温度为40 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F005图5干燥温度对活菌数影响2.3.4发酵液浓缩倍数对德沃斯氏菌D-8活菌数影响（见图6）由图6可知，浓缩倍数为2.5~10.0倍时制得菌剂活菌数均≥11 lgCFU/g，浓缩倍数为5倍时活菌数达到最大；当浓缩倍数大于10倍时，随着浓缩倍数的增加，活菌数逐渐降低，活菌数均在10 lgCFU/g。因此，确定发酵液浓缩倍数为5倍。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F006图6浓缩菌液倍数对活菌数影响2.3.5制备菌剂水分含量对德沃斯氏菌D-8活菌数影响（见图7）较高水分含量导致菌剂发霉变质，较低水分含量会延长干燥时长，增加干燥成本。由图7可知，当控制菌剂水分含量为10%时，活菌数可以达到（12.10±0.02）lgCFU/g，其余水分含量均可以达到11 lgCFU/g。因此，确定制备菌剂含水量为10%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F007图7水分含量对活菌数影响2.3.6正交试验及方差分析结果（见表2、表3）根据单因素试验结果选用对活菌数影响较大因素干燥温度（A）、浓缩倍数（B）、水分含量（C），以菌剂活菌数为指标进行正交试验，以获得各因素在不同水平下的试验数据，每个试验重复3次取平均值。由表2可知，RARCRB，即干燥温度（A）对活菌数影响较大，菌剂水分含量（C）次之，而浓缩倍数的影响（B）最小。由表3可知，干燥温度具有显著性影响（P0.05）。综合极差分析结果，各因素最优配比为A1B3C1，即干燥温度40 ℃、浓缩倍数10.0倍、水分含量10%时，德沃斯氏菌D-8活菌数达到最大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.T002表2正交试验结果项目ABCD空列活菌数/lgCFU/g1111112.14±0.062122212.17±0.043133312.03±0.074212310.84±0.035223110.65±0.166231211.46±0.42731329.25±0.06832139.30±0.05933219.22±0.09K136.3432.2332.9032.01K232.9532.1232.2332.88K327.7732.7131.9332.17k112.1110.7410.9710.67k210.9810.7110.7410.96k39.2610.9010.6410.72R2.850.190.330.2910.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.T003表3方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值模型12.63662.10629.3370.033截距1 046.63011 046.63014 579.8440.001A12.40626.20386.4060.011B0.06420.0320.4490.690C0.16620.0831.1550.464误差0.14420.072注：1.本模型回归系数R2=0.989，调整后R2=0.955。2.P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.3.7最佳工艺验证试验根据单因素及正交试验结果，采用最佳发酵时长及鼓风干燥法工艺进行菌剂制备，即发酵21 h菌液浓缩倍数为10倍，与40~80目玉米粉充分混匀，40 ℃低温干燥控制水分含量为10%。鼓风干燥制备菌剂形态见图8。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F008图8鼓风干燥制备菌剂形态由图8可知，菌剂保留玉米粉形态，颗粒较为均一，颜色较制备前变化不大。菌剂在水中自然散开并沉降于液体底部，经振荡可短暂悬浮，检测德沃斯氏菌D-8活菌数达（12.38±0.11）lgCFU/g。2.4菌剂微观结构观察及分析（见图9、图10）由图9可知，菌株长约1 μm，宽约0.5 μm，呈椭球棒状，团聚分布于玉米粉微观表面沟壑中，菌体轮廓明显，形态完整且饱满。随机观测不同玉米粉颗粒表面均能够发现菌株团聚附着现象，表明该菌株较为均匀分布于玉米粉颗粒材料中。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F009图9菌剂制备前后扫描电镜（10 000×）由图10（b）可知，以相同粒径玉米蛋白粉为载体材料时，菌株团聚附着于载体蛋白表面褶皱中，极少分布于突起脊部分，与玉米粉为载体材料依附情况一致；但以蛋白粉作为载体时，菌体不够饱满，干扁较多。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.F010图10不同载体菌剂扫描电镜（10 000×）由图10（c）可知，玉米淀粉作为载体时，相比于玉米粉表面凹凸不平相比，淀粉颗粒更加细小，且表面光滑，菌体依附于淀粉表面且或呈融合状态。2.5菌剂储藏过程德沃斯氏菌D-8活菌数变化（见表4）由表4可知，德沃斯氏菌D-8的菌剂初始活菌数为（12.38±0.11）lgCFU/g。4 ℃储藏活菌数在储藏30 d后，真空存储的菌剂活菌数优于非真空储藏，德沃斯氏菌D-8菌剂活菌数为（10.80±0.10）lgCFU/g；德沃斯氏菌D-8菌剂在储藏60 d后，活菌数下降一个数量级为（9.38±0.08）lgCFU/g，在60~90 d，活菌数下降至（9.04±0.18）lgCFU/g且趋于稳定。与4 ℃相比，在25 ℃和37 ℃储藏30 d时，活菌数损失较大，仅为6~7 lgCFU/g。因此，德沃斯氏菌D-8菌剂的最佳储藏条件为4 ℃真空储藏。该条件下可在30 d内保持较高的活菌数。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2023.14.015.T004表4菌剂储藏过程活菌数德沃斯氏菌D-8变化储藏条件初始活菌数30 d活菌数60 d活菌数90 d活菌数4 ℃真空储藏12.38±0.1110.80±0.10a9.34±0.08a9.04±0.18a4 ℃非真空储藏12.38±0.119.96±0.10b8.97±0.56a8.94±0.34a25 ℃真空储藏12.38±0.117.35±0.07c6.81±0.72b6.08±0.05b25 ℃非真空储藏12.38±0.117.25±0.09c6.68±0.05b6.23±0.07b37 ℃真空储藏12.38±0.116.63±0.21d5.05±0.08c4.89±0.16c37 ℃非真空储藏12.38±0.116.50±0.28d5.13±0.32c4.92±0.11c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。lgCFU/g3讨论3.1菌剂制备工艺对德沃斯氏菌D-8活菌数影响有效活菌数是评判菌剂品质的关键指标。本试验以德沃斯氏菌D-8活菌数为评价指标，以单因素和正交试验确定干燥方式并优化制备工艺，优化制备工艺后菌剂活菌数较优化前提高了10倍。由于DON降解菌德沃斯氏菌D-8为不产芽孢的革兰氏阴性菌[18]，细胞壁结构较薄，制备过程中的高温环境不利于维持菌株活性。本试验结果表明，使用低温鼓风干燥制备工艺，菌剂活菌数可达（12.38±0.11）lgCFU/g，故而选择较为温和的低温鼓风干燥法更利于保持较高的菌剂活性。此外，与冷冻干燥法和喷雾干燥法相比，低温鼓风干燥法具有工艺简单、高效率，低能耗、低成本等诸多优势[19]。因此，低温鼓风干燥法可较好地应用于德沃斯氏菌菌剂的生产制备。3.2菌剂表面微观结构分析玉米粉由玉米籽粒破碎后制得，主要成分是淀粉、其次是蛋白质，是一种易得的可再生资源和载体材料[20]。本试验通过微观结构发现，德沃斯氏菌D-8菌体主要分布在物料的微观褶皱中，而玉米粉作为载体材料的菌剂活菌数略高于淀粉，显著高于玉米蛋白粉。因此，玉米粉成分中的淀粉起主要保护作用，而玉米粉表面的不规则褶皱结构更利于德沃斯氏菌的依附。此外，与精制的玉米淀粉和蛋白粉相比，玉米粉具有较好的价格优势，作为载体填料可较好地应用于德沃斯氏菌D-8菌剂的生产制备。4结论本试验以高活菌数为评价指标，研究德沃斯氏菌D-8菌剂最佳制备工艺，通过单因素与正交试验确定制备工艺为德沃斯氏菌D-8发酵21 h后浓缩10倍，并与40~80目玉米粉载体充分混合，使用低温鼓风干燥法进行菌剂干燥，温度40 ℃，控制水分含量10%，制备菌剂活菌数可达到（12.38±0.11）lgCFU/g。德沃斯氏菌D-8菌剂在4 ℃真空储藏30 d内，活菌数可保持10 lgCFU/g以上。